露兜树作为一种兼具药用价值的热带植物，其叶片与果实富含酚类、黄酮类、萜类、甾体等多种生物活性成分，已被证实具有抗炎、抗氧化、抗菌等功效，在人类疾病治疗及陆生动物养殖中已有应用。
已有研究表明，露兜树叶提取物可显著提升鲤鱼的生长性能与抗病能力（Chi Cheng 等人，2022），其对水生动物病原菌的抑制作用也得到验证（Yosie Andriani 等人，2019），但针对南美白对虾抗副溶血性弧菌的作用及机制尚未深入阐释。基于此，本研究通过室内控制实验，系统探究露兜树叶提取物对南美白对虾的免疫增强效果及抗病机制，旨在为对虾绿色养殖技术的研发提供理论支撑。
一、实验材料：
1、实验对象：南美白对虾幼虾购自马来西亚登嘉楼iSHARP Sdn. Bhd.公司，体长均一（约1cm）、活力良好、无明显病害症状。
2、提取物制备：采集新鲜露兜树叶，洗净后置于60℃烘箱烘干至恒重，经粉碎机粉碎过40目筛，采用70%乙醇溶液回流提取2次，每次2h，合并提取液并减压浓缩，冷冻干燥后得到露兜树叶提取物粉末，实验时用无菌海水配制成0.5、1、2、3、4、5、6g/L共7个浓度梯度的备用液。
3、病原菌：副溶血性弧菌菌株由实验室保存，经LB液体培养基28℃振荡培养12h后，用无菌生理盐水调整菌液浓度至1×10⁶ CFU/ml，备用。
二、实验设计：
1、虾苗驯化：实验前将幼虾置于温度28℃、盐度38‰的循环养殖系统中驯化2周，持续充氧保证溶氧量≥6mg/L，养殖密度为2000尾/L，每日分2次投喂鲜活卤虫幼体，每2天更换1/2养殖水体，维持水质稳定。每日观察虾苗活动状态，及时剔除病弱个体。
2、分组与处理：选取健康幼虾300尾，随机分为8组，每组3个重复，每个重复10尾虾。其中7组为实验组，分别置于上述不同浓度的露兜树叶提取物溶液中浸泡24h；1组为对照组，置于不含提取物的无菌海水中同等条件处理。
3、病原菌感染：浸泡处理结束后，所有实验组与对照组幼虾均采用浸浴感染法，置于浓度为1×10⁶ CFU/ml的副溶血性弧菌菌液中感染24h，感染期间维持水温、盐度等环境参数与驯化期一致。
4、指标测定：感染结束后，统计各组幼虾存活率；采用平板计数法测定虾体肝胰腺内的细菌负荷；通过实时荧光定量PCR技术检测免疫相关基因（Hsp70、ProPO、peroxinectin、penaeidin、crustin、transglutaminase）的mRNA表达水平；取虾体肝胰组织制作石蜡切片，经HE染色后在光学显微镜下观察组织形态结构。
5、重复性验证：为确保实验结果可靠性，整个实验流程重复2次，数据取两次重复的平均值进行统计分析。
三、实验结果：
1、露兜树叶提取物对南美白对虾存活率的影响：
不同浓度露兜树叶提取物处理均能提升南美白对虾感染副溶血性弧菌后的存活率，且呈现明显的浓度依赖性。当提取物浓度为6g/L时，对虾存活率达到最高，较对照组提升95%；在中等致死剂量弧菌挑战试验中，该浓度组存活率较对照组提升15%，显著优于其他浓度梯度组。而低浓度组（0.5~1g/L）对虾存活率与对照组无显著差异，表明露兜树叶提取物的抗病效果需达到一定浓度阈值方可体现。
2、露兜树叶提取物对虾体细菌负荷及免疫基因表达的影响：
6g/L露兜树叶提取物处理组虾体肝胰腺内副溶血性弧菌数量较对照组显著降低，表明提取物可有效抑制病原菌在宿主体内的增殖。免疫基因表达检测结果显示，6g/L浓度处理可显著上调Hsp70、crustin及proPO的mRNA表达水平，分别较对照组提升8.5倍、10.4倍和1.5倍；而peroxinectin、penaeidin等其他免疫基因的表达量无明显变化。这一结果提示，露兜树叶提取物主要通过调控Hsp70介导的免疫通路发挥作用，Hsp70作为关键中介因子，可激活酚氧化酶原系统，进而增强虾体的抗菌免疫应答。
3、露兜树叶提取物对虾体肝胰管组织形态的影响：
组织学观察结果显示，经6g/L露兜树叶提取物处理后再感染副溶血性弧菌的对虾，其肝胰管结构完整，胆管壁光滑，上皮细胞（包括Blassenzelen细胞、Fibrillendene细胞和Restzellen细胞）排列整齐，无明显退化或损伤现象。而对照组对虾（仅感染弧菌未处理提取物）的肝胰管出现明显病理变化，胆管上皮细胞大量脱落，细胞数量显著减少，肝胰管结构完整性遭到严重破坏。这一结果证实，露兜树叶提取物可有效保护对虾肝胰组织免受病原菌侵害，其作用机制与提取物中含有的咖啡酰奎宁酸、维生素、肉桂酸酯等抗氧化成分密切相关。
四、讨论：
本研究结果明确了露兜树叶提取物对南美白对虾抗副溶血性弧菌的保护作用，其核心机制可归纳为两个方面：一是提取物中的酚类、黄酮类等抗菌成分可直接抑制副溶血性弧菌的增殖，降低病原菌在虾体内的定植能力，从而减少菌体对组织的损伤；二是通过上调Hsp70、crustin等免疫相关基因的表达，激活虾体固有免疫系统，增强机体对病原菌的清除能力。
在浓度梯度实验中，6g/L为最优处理浓度，这一结果为实际养殖应用提供了精准的剂量参考。与传统抗生素相比，露兜树叶提取物不仅无耐药性诱导风险，还能改善养殖环境，符合水产养殖业绿色发展的需求。此外，露兜树作为热带地区广泛分布的植物，资源丰富、提取成本较低，具备大规模推广应用的潜力。
五、结论：
本研究证实，6g/L露兜树叶提取物浸泡南美白对虾幼虾24h，可通过抑制副溶血性弧菌增殖、上调免疫相关基因表达、保护肝胰管组织结构完整性，显著提升对虾的抗病能力。该技术为对虾养殖病害的绿色防控提供了新途径，同时也拓展了露兜树药用资源的应用领域。未来可基于本研究结果，开发针对性的对虾免疫增强剂，推动水产养殖产业的高质量发展。
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