骨关节炎不只是“磨损”，而是关节内部的“炎症风暴”在破坏软骨。科学家发现，一种叫WTAP的蛋白在患者关节里异常增多，它会给一个叫 FRZB 的“刹车基因”贴上RNA标签（m⁶A）让这个“刹车”失效。
2024年1月4日，南京大学医学院附属鼓楼医院徐兴全/蒋青研究团队在Experimental & Molecular Medicine杂志发表了“WTAP-mediated m6A modification of FRZB triggers the inflammatory response via the Wnt signaling pathway in osteoarthritis”揭示了WTAP介导的FRZB的m⁶A修饰通过Wnt信号通路触发骨关节炎中的炎症反应。
越来越多的证据表明，RNA的N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰在骨关节炎（OA）发病中发挥重要作用。本研究发现，在多种m⁶A“写入蛋白”中，Wilms肿瘤1相关蛋白（WTAP）在临床OA软骨中表达显著升高并促进软骨细胞外基质降解、炎症反应和氧化应激。通过MeRIP-seq与RNA-seq联合分析，研究人员鉴定出Wnt通路拮抗因子卷曲相关蛋白（FRZB）为关键下游靶点：其mRNA在OA软骨中m⁶A修饰水平升高，导致表达显著下调。WTAP通过m⁶A依赖的方式抑制FRZB，从而解除对Wnt/β-catenin信号通路的抑制，激活该通路并诱发软骨损伤表型。
在小鼠OA模型中，关节腔内注射AAV-WTAP反而缓解了疾病进展，而这一保护作用可被Wnt/β-catenin通路激活剂逆转，提示WTAP-FRZB轴在调控OA进程中的核心地位。综上，该研究揭示了WTAP介导的m⁶A修饰通过转录后抑制FRZB，异常激活Wnt/β-catenin通路驱动OA发展，为靶向RNA表观转录调控治疗骨关节炎提供了新策略。
图一 WTAP在TNF-α诱导的软骨细胞和骨关节炎软骨中表达上调
首先，作者检测了临床骨关节炎软骨中主要m⁶A甲基化相关基因的表达，结果表明WTAP是唯一显著上调的甲基转移酶。
为构建细胞水平的骨关节炎模型，使用促炎细胞因子TNF-α处理人软骨细胞。随后，通过软骨基质代谢相关基因和炎症相关基因的mRNA表达升高以及ADAMTS4、ADAMTS5和MMP13蛋白表达增加，证实了类骨关节炎表型的形成。此外，由于软骨中活性氧（ROS）水平升高与骨关节炎进展相关，作者发现经TNF-α刺激的软骨细胞中ROS水平明显上升。值得注意的是，用50 ng/ml TNF-α处理24小时的软骨细胞表现出明显的类骨关节炎表型，因此该条件被用于后续实验。
接下来，在该细胞骨关节炎模型中进一步检测了主要m⁶A甲基化相关基因的表达。在经50 ng/ml TNF-α诱导的软骨细胞中，WTAP的mRNA表达上调最为显著，同时作者也确认了TNF-α处理后软骨细胞中WTAP蛋白表达的升高。这些结果表明，WTAP在骨关节炎软骨中高表达，并可能在骨关节炎进展中发挥重要作用。
图二 敲除WTAP可缓解骨关节炎软骨细胞的表型
为了评估WTAP在骨关节炎中的作用，作者将过表达WTAP的质粒（flag-WTAP）转染至软骨细胞。经过新霉素筛选24小时后，通过qRT-PCR和Western blotting确认了WTAP的mRNA和蛋白水平显著升高。免疫荧光检测结果也显示软骨细胞中WTAP蛋白表达增加，且WTAP过表达后m⁶A甲基化水平升高。
为评估WTAP对骨关节炎软骨细胞表型的影响，作者检测了ADAMTS4、ADAMTS5、MMP13、IL-6、IL-8和iNOS的mRNA表达水平以及ADAMTS4、ADAMTS5和MMP13的蛋白表达水平，发现它们在WTAP过表达后均显著升高。此外，与对照组相比，过表达WTAP的软骨细胞中活性氧的产生也显著增加。进一步地，作者使用慢病毒转染软骨细胞以敲除WTAP。
经筛选后确定嘌呤霉素的最佳浓度为2.5 μg/mL。在转染第七天，TNF-α处理对转染效率无明显影响。在TNF-α刺激下，WTAP敲除细胞模型中WTAP的mRNA和蛋白水平均显著降低。免疫荧光结果也证实了WTAP慢病毒的有效转染。敲除WTAP后，软骨细胞中的m⁶A水平下降并显著降低了骨关节炎相关基因的mRNA及蛋白表达水平。此外，WTAP敲除还减弱了TNF-α诱导的软骨细胞中活性氧的积累。
综上所述，这些结果表明WTAP参与调控骨关节炎软骨细胞的表型。
图三 抑制WTAP可通过失活Wnt/β-catenin信号通路缓解骨关节炎进展
为了探究WTAP是否在体内参与骨关节炎进展，作者通过关节腔注射对照病毒或携带WTAP干扰序列的腺相关病毒（AAV siWTAP）至DMM诱导的骨关节炎小鼠模型中。敲低效率通过免疫组化得到验证。番红O-快绿染色结果显示，接受AAV siWTAP治疗的小鼠软骨表面损伤明显改善，而对照组则无此效果。
OARSI评分的定量分析表明，对照组小鼠的OARSI评分显著升高，而siWTAP治疗组评分明显降低。免疫组化结果进一步显示，AAV siWTAP注射可缓解骨关节炎小鼠模型中软骨基质的退行性改变，包括分解代谢反应减弱和细胞外基质成分增加。与体外实验结果一致，siWTAP通过抑制FRZB表达使Wnt/β-catenin通路失活，从而改善骨关节炎软骨的降解。
此外，作者发现使用SKL2001激活Wnt/β-catenin信号通路可完全消除siWTAP对骨关节炎软骨及OARSI评分的保护作用。还通过旷场实验（）和足迹分析进一步证实了siWTAP对骨关节炎表型的抑制作用。值得注意的是，在主要器官的组织结构中观察到siWTAP和SKL2001具有良好的生物相容性。这些结果表明，β-catenin通路在WTAP促进骨关节炎软骨分解代谢改变及疾病发展中起关键作用。
总结
本研究揭示了WTAP依赖的RNA m⁶A修饰水平升高会加剧骨关节炎软骨的退变与疾病进展。WTAP以m⁶A依赖的方式稳定FRZB mRNA并激活骨关节炎软骨细胞中的Wnt/β-catenin信号通路。作者的研究结果表明，WTAP介导的RNA m⁶A修饰失调可能是骨关节炎治疗的一个有前景的干预靶点。
文章来源
https://doi.org/10.1038/s12276-023-01135-5
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