内毒素是一种由细菌细胞壁分解产生的毒性物质,其主要成分为脂多糖（LPS），是细胞培养过程中不容忽视的问题。细胞培养试剂或介质内毒素过高，会干扰细胞的正常生长和分化，甚至导致实验失败。内毒素通过诱导炎症反应抑制细胞生长或诱导其凋亡。研究发现，低浓度内毒素（< 1 ng/mL，1 ng ≈ 10 EU）可刺激细胞产生细胞因子、激活小鼠巨噬细胞。
内毒素如何偷偷毁掉细胞实验？
细胞莫名其妙死亡、转染效率低至 30%、同样的 protocol 却做不出重复结果——遇到这些问题，你的第一反应是什么？细胞状态不好？血清批次有问题？转染试剂不给力？
很少有人会想到这可能是内毒素在「捣乱」。它隐藏在细胞培养基、添加物、质粒中，难以被发现，却悄无声息地吞噬着实验数据和结果。内毒素可能从一开始就在那里，只是你从来没测过。
你以为培养基澄清透明就是干净的？你以为「内毒素达标」就安全了？药典标准是 0.5 EU/mL，但你的细胞实验需要的，可能是比药典严苛 10 倍的条件。内毒素是细胞培养中最容易被忽视的「潜伏者」。它藏在血清里、藏在重组蛋白里、藏在质粒里，悄无声息地篡改你的实验数据。这一次，我们来聊聊这个你「以为知道」、但可能低估了的隐形杀手。
一、0.02 ng/mL 的内毒素就能对细胞培养产生影响
多种细胞易受内毒素影响，如巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、肝细胞、血小板、内皮细胞等。极低浓度的内毒素就能干扰细胞正常的生理功能。Schwarz H 等人发现 0.02～2 ng/m L的脂多糖（LPS）能激活细胞的免疫反应，且不同细胞对内毒素的敏感度不一样。如 THP-1 细胞在受到最高浓度 LPS（2 ng/mL）刺激时，仅 IL-8 表达量显著增加，而在相同浓度下，moDCs 会大量分泌 IL-6、IL-8、IL-12 和 TNF-α。人单核细胞和 CD1c+ DCs 对内毒素更敏感，0.2 ng/mL 的 LPS 能够诱导所有细胞因子释放。
0.02 ng/mL 是什么概念？相当于在标准游泳池里滴入一滴水，浓度低到可以忽略不计。但对于 THP-1 细胞、树突状细胞、原代免疫细胞来说，这个浓度的内毒素足以让它们「炸锅」，细胞还没开始正式实验，就已经被「提前激活」了。
低浓度 LPS 对不同人类免疫细胞细胞因子产生的影响（源自文献：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）
内毒素能够与细胞膜上的受体结合，激活免疫反应，释放 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎性细胞因子，影响细胞生理功能和信号通路紊乱，进而影响细胞生长和代谢，甚至造成细胞凋亡。内毒素提前激活免疫细胞会干扰对细胞因子正常免疫调节功能的研究，出现实验结果偏差。
内毒素过高会造成细胞形态发生明显变化，如体积缩小、折光率降低等。内毒素还抑制细胞的增殖，如 G0/G1 期延长、S 期缩短等会导致细胞生长停滞或凋亡。内毒素在敏感细胞中诱导 caspase-3 介导的凋亡通路，使原代细胞存活率骤降。内毒素通过磷酸基团与细胞膜上的蛋白质发生反应，或脂肪酸链与细胞膜上的脂质膜和蛋白质亲水区发生作用，改变细胞膜形态，导致细胞功能障碍。
研究人员通过 MTT 法测定了脂多糖（LPS）对 H292 和 THP-1 细胞的毒性作用。结果发现，与未处理的对照组相比，低浓度（1～2.5 μg/mL） LPS 处理后，细胞活力未观察到显著变化，表明此浓度下的 LPS 对细胞无毒性。而高浓度（5～20 μg/mL）的 LPS 对 H292 和 THP-1 细胞具有显著的细胞毒性。
LPS 刺激对 H292 与 THP-1 细胞活力的影响（源自文献：DOI：10.3892/mmr.2018.8542）
内毒素对细胞功能有显著影响，如影响细胞的基因表达、能量代谢和蛋白质合成。内毒素还会与转染试剂、质粒 DNA 降低细胞转染效率。
因此，在细胞培养实验中，内毒素影响细胞的生理状态和功能，降低实验的可靠性和可重复性，此外，内毒素的存在可能影响细胞因子和蛋白质的表达控制，细胞信号通路、蛋白质相互作用等研究需要注意内毒素的干扰。对于细胞衍生产品（如疫苗、免疫细胞治疗等）更应关注内毒素污染。
二. 细胞培养过程中如何避免内毒素污染
革兰氏阴性菌是细胞培养环境中的常见污染源，细菌死亡裂解或导致内毒素释放。培养基中的血清或蛋白质成分含有较高内毒素也会影响细胞生长。在细胞的传代、冻存等环节操作不当也会导致内毒素污染。细胞培养所有容器和包装材料也会因制造工艺而含有内毒素。
针对内毒素污染的来源，可以通过以下措施控制内毒素：
原料控制：选择低内毒素或超低内毒素的试剂和介质，从源头控制内毒素。
细胞株选择：某些肿瘤细胞株对内毒素敏感度较低可优先选择。
培养环境选择：定期杀菌和在位清洗，减少大肠杆菌污染。优化细胞培养条件，如温度、pH 值、渗透压等，以降低内毒素对细胞的不良影响。
质量控制：对所用试剂进行内毒素检测，保证内毒素含量符合标准。
人员培训：确保操作合规，避免人员操作问题引入细菌内毒素。
三、重组蛋白内毒素对细胞培养的影响
重组细胞因子在细胞培养和扩增分化过程中具有重要作用。免疫学实验、细胞凋亡实验、干细胞培养与分化、类器官模型构建等，都需要使用低水平内毒素的细胞因子。细胞因子功能分析、蛋白互作研究，使用更低水平内毒素的重组蛋白是获取可靠实验结果的基础。
为评估重组蛋白中内毒素对细胞的免疫反应，Schwarz H 等人构建了对 LPS 高度敏感的 HEK293 细胞，将这些细胞分别暴露于不同浓度的重组蛋白（来自两个不同的供应商）和 LPS 中。结果显示，供应商 1 的重组蛋白可使 NF-kB 表达量升高，而供应商 2 的重组蛋白则未激活 NF-kB 表达。供应商 1 重组蛋白诱导 NF-kB 表达的效果与 0.02 ng/mL LPS 相近，说明重组蛋白中少量内毒素污染（1.4 EU，0.014 ng/100 ng 蛋白）足以激活 NF-κB 通路。
内毒素对 HEK293 细胞中 NF-kB 激活的影响（源自文献：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）
内毒素污染自查清单
你中了几条？
以下场景，如果你中了 3 条以上，你的实验数据可能正在被内毒素「偷走」。
试剂耗材篇
用的重组蛋白、细胞因子，从来没测过内毒素水平
只知道内毒素「达标」（< 0.5 EU/mL），不知道自己的细胞需要多低的阈值
血清分装后反复冻融，瓶口有肉眼可见的残留
用的超纯水，超过一周没换机、没测电阻率
日常操作篇
培养基配制后，存放超过两周还在用
枪头、离心管是「国产某品牌」，但没验证过无热原
开瓶后的试剂，瓶盖朝下放在台面上
细胞房里的酒精棉球，泡了三天没换
培养环境篇
培养箱水盘里的水，一个月没换过
细胞房最近有过细菌污染，简单消杀后继续用
同一瓶培养基，同时养免疫细胞和肿瘤细胞
做原代细胞培养，没单独配一瓶「专用培养基」
细胞状态篇
细胞长得慢，第一反应是「血清不行」，而不是测一下内毒素
转染效率突然下降，怀疑是质粒问题，没想过是内毒素干扰
同样 protocol，两个人做出来结果不一样，以为是操作问题
细胞形态没变、培养基也没浑，就默认「没问题」
如果你中了 3 条以上，建议下次实验前，先测一下你的培养基、血清、重组蛋白——内毒素这个「隐形杀手」，可能比你想象的离你更近。自查清单里那些「坑」，有些靠规范操作就能填上——比如勤换水、不反复冻融、分区使用培养基。但有些问题，不是操作能解决的：你用的重组蛋白本身自带内毒素，换再多枪头、擦再多遍台面也没用。这时候就需要从源头入手——选择真正「超低内毒素」的试剂，而不是只看标签上写着「达标」。
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义翘神州位于德克萨斯州的生物工程中心（C4B）采用先进的技术和设备生产 ProPure™ 超低内毒素蛋白，内毒素水平低于定量限（BQL）（< 0.05 EU/mg），显著优于行业标准（USP <85>：0.5 EU/mg），适用于临床前动物研究、严格的细胞实验与高敏检测分析。同时，C4B 还提供超低内毒素蛋白定制服务，满足临床前和药物开发中对内毒素控制的更高标准需求。
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内容策划：王丹琦
内容审核：周育红
题图来源：图虫创意
参考文献：
[1] Schwarz H, et al. Residual Endotoxin Contaminations in Recombinant Proteins Are Sufficient to Activate Human CD1c+ Dendritic Cells. PLoS ONE. 2014. doi:10.1371/journal.pone.0113840
[2] Xuefang Liu, et al. LPS‑induced proinflammatory cytokine expression in human airway epithelial cells and macrophages via NF-κB, STAT3 or AP-1 activation. Mol Med Rep. 2018. doi: 10.3892/mmr.2018.8542
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