近日，浙江大学的杨帆团队、郭江涛团队、杨巍团队，以及深势科技温翰团队合作的最新成果在Nature Chemical Biology上发表。该项研究解决了TRPV2内源性抑制剂胆固醇及经典外源性激动剂2-APB与TRPV2相互作用的结构和动力学机理这一悬而未决的问题。研究表明2-APB和胆固醇分子竞争结合同一个位于跨膜区的经典VBP口袋，并且雌二醇会对结合产生影响。深势科技与杨帆课题组将持续就TRP家族通道蛋白的机理研究和药物研发展开长期而深入的合作。

对温度和触觉的感知是人类赖以生存的重要能力，也是我们与周围世界互动的基础。能够感知温度和触碰的神经脉冲是如何产生的？数百年来众多科学家对此进行了密集的研究。TRPV2和TRPV1、TRPM8等人体温度感受TRP（Transient Receptor Potential ）通道的发现者David Julius教授、Ardem Patapoutian教授更是因此获得了2021年诺贝尔生理学或医学奖。

在不同的TRP通道蛋白中，TRPV2离子通道是TRP通道香草醛（Vanilloid）亚家族中的重要成员。TRPV2通道具有目前已知最高的温度激活阈值，可以被超过50℃的高温激活，在生理病理中具有丰富功能。但是，人们对TRPV2的生理病理作用的认识尚待深入。例如，TRPV2通道是否受到内源性分子的调控，其外源性激动剂是如何结合并激活该通道，都是尚未回答的科学问题。

2022年9月26日，来自浙江大学基础医学院生物物理学系的杨帆团队、郭江涛团队、杨巍团队和来自深势科技的温翰团队在Nature Chemical Biology杂志上合作发表了研究论文“Structural mechanisms of TRPV2 modulation by endogenous and exogenous ligands”，发现细胞膜的重要组成分子-胆固醇，是TRPV2通道的内源性抑制剂；而TRPV2的经典外源性激动剂2-APB，和胆固醇分子竞争结合同一个位于跨膜区的口袋。胆固醇与2-APB分别引起TRPV2通道S4-S5 linker的内移和外摆，从而抑制或激活该通道。

论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41589-022-01139-8

与常规基于质谱的结合分子发现的研究范式不同，该研究团队首先通过单颗粒冷冻电镜技术，在不添加胆固醇或其类似物的条件下，解析了小鼠TRPV2通道的高分辨率三维结构（mTRPV2CHL，3.17Å）。研究人员对该结构进行分析，发现在跨膜区由S4、S5和S4-S5 linker等形成Vanilloid Binding Pocket（VBP）中，出现了一个与胆固醇分子十分类似的电子云密度。环糊精（MβCD）可以去除细胞膜上的胆固醇，为了验证该密度是否为胆固醇分子，研究人员在纯化TRPV2蛋白过程中用环糊精进行处理。经过环糊精处理的TRPV2冷冻电镜结构中（mTRPV2MβCD，2.89Å），VBP里面没有观察到mTRPV2CHL结构中类似胆固醇分子的电子云密度。在后续实验中，研究人员在环糊精处理的TRPV2蛋白加入外源胆固醇，又可以在VBP中看到类似胆固醇的电子云密度。因此，研究人员确信细胞内源性胆固醇分子可以结合在TRPV2通道的VBP。

图1.内源性胆固醇分子（红色）结合在小鼠TRPV2通道的VBP口袋。

VBP是TRP通道上经典的调控分子结合口袋，例如在TRPV1通道上，辣椒素、RTX等分子均结合在VBP。因此，研究人员推测胆固醇在TRPV2通道的VBP结合也能发挥调控作用。通过使用膜片钳电生理记录，研究人员发现，胆固醇或其可溶性更高的类似物CHS均能很好抑制TRPV2的配体激活，其IC50在微摩尔水平（74.6±25.1µM）。胆固醇在血液与细胞膜中的浓度可以高至数百微摩尔乃至毫摩尔，故研究人员推测，体内的TRPV2通道可能处于长期被胆固醇抑制的状态。

图2.电生理记录表明，胆固醇分子抑制TRPV2通道的配体激活。

从mTRPV2CHL结构上，可以看到胆固醇分子的羟基与TRPV2通道S4-S5 linker上的Q525位点接近，并且电镜密度图上可以观察到疑似水分子的密度云，进而通过全原子分子动力学模拟，证实了通过胆固醇和Q525通过水分子会形成局部氢键网络帮助结合。研究人员通过在TRPV2的VBP引入大量的点突变并进行电生理记录，发现Q525F与Q525T两个点突变都可以完全消除胆固醇分子的抑制作用。研究人员进一步解析了这两个点突变TRPV2通道的三维结构（mTRPV2Q525F，2.59Å；mTRPV2Q525T，2.47Å），阐明了突变影响胆固醇作用的机制。

研究人员进一步发现，雌二醇作为胆固醇的衍生物，不仅不抑制TRPV2通道，反而可以增强TRPV2的经典外源性激动剂2-APB分子的作用。研究人员解析了单独加入雌二醇（mTRPV2E2，2.77Å）、雌二醇与2-APB共同加入（mTRPV2E2_A-APB，3.27Å）以及环糊精处理后单独加入2-APB（mTRPV2MβCD_2-APB，2.83Å）三种状况下TRPV2通道的高分辨率三维结构。通过结构比较，发现雌二醇影响了胆固醇的结合，而且2-APB分子也结合在VBP口袋。通过在VBP口袋引入点突变，在电生理记录中可以看到2-APB的激活被完全消除，进一步验证了2-APB的结合方式。

图3.TRPV2通道的经典激动剂2-APB也结合在VBP口袋。

在这一系列TRPV2结构的基础上，研究人员进行了全原子和粗粒化的分子动力学模拟。通过模拟，发现胆固醇和2-APB都可以稳定地结合在VBP，但是2-APB分子离开VBP口袋时，需要跨越较高的能垒，所以其结合更稳定。这就解释了在活细胞中，虽然内源性胆固醇分子占据了VBP口袋，但是2-APB的加入仍然可以竞争该口袋并激活TRPV2通道。

图4.左图：分子动力学模拟表明，2-APB离开VBP口袋需要跨越较胆固醇更高的能垒；右图：TRPV2通道受内源性胆固醇抑制与外源性2-APB激动的机制。

本项工作运用冷冻电镜、电生理实验和计算模拟三位一体的方法研究科学问题。这种学科交叉融合的研究范式在以离子通道为代表的底层机理研究中发挥着愈发重要的作用，论文在同行评议过程中也是得到了领域权威的高度评价。深势科技作为AI for Science的先行者、分子模拟的领跑者，展现了在离子通道模拟方面完善的基础设施和深厚的科学底蕴。通过Uni-EM（hermite.dp.tech）极大加速了电镜结构的初步搭建，通过其微尺度科学计算云平台Bohrium（bohrium.dp.tech）实现了算力的集中灵活调度。使用了包括全原子分子动力学模拟、增强采样、粗粒化模型等多尺度模拟手段在原子层面揭示了2APB、胆固醇和TRPV2的作用机理，并精确刻画了水分子介导的相互作用细节、点突变对相互作用的影响，跟功能实验和冷冻电镜结果相吻合，并为进一步针对这个相互作用位点的药物研发提供了理论支持。通过模拟也观察到了雌二醇在系统中的分布，跟TRPV2广泛的相互作用及对胆固醇结合的扰动。

图5.加入雌二醇的情况下模拟当中雌二醇的分布（红色）和胆固醇的结合分布（青色）。

图6.2APB在模拟中结合TRPV2的过程，基于真实轨迹使用diffusion model艺术加工后的效果图。

未来，深势科技将充分利用自身在计算方面的专长，对离子通道机理和结构动力学的深刻理解，通过计算出发开发靶向各型具有重要功能离子通道的药物，与杨帆课题组就TRP家族通道蛋白的机理研究和药物研发展开长期而深入的合作。

关于杨帆课题组

杨帆课题组专注于离子通道膜蛋白的功能与动态构象变化研究，以及基于蛋白质三维结构的生物大分子理性设计。围绕着刺激感受的TRP通道，深入研究了低温、高温、辣椒素、薄荷醇以及多肽大分子等多种物理化学因素调控TRP通道的机制，并开发了针对TRP通道的具有镇痛效果的调控分子。2017年实验建立以来，在Nature（2022）、Nature Chemical Biology（2022）、Science Translational Medicine（2022）、Nature Communications（2022，2020a，2020b，2020c，2019，2018）、PNAS（2020）、Advanced Science（2021a，2021b，2020）、National Science Review（2019）、PloS Biology（2018）等知名学术期刊上以通讯作者（含共同）身份发表多篇文章。

杨帆课题组目前在膜蛋白结构解析、电生理、蛋白质计算建模与理性设计等研究方向招聘博士后，详细信息请见实验室网站：https://person.zju.edu.cn/fanyang

关于深势科技

深势科技是“AI for Science”科学研究范式的先行者，致力于运用人工智能和分子模拟算法，结合先进计算手段求解重要科学问题，为人类文明最基础的生物医药、能源、材料和信息科学与工程研究打造新一代微尺度工业设计和仿真平台。

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