过氧化物酶体上由相分离形成的蛋白转运通道

撰文 | 言笑

过氧化物酶体是进行脂肪酸和氨基酸β氧化的细胞器，其功能障碍与多种疾病相关【1】。致病变异基因包括蛋白质转运到过氧化物酶体所需的基因。折叠的蛋白质和复合物易位到过氧化物酶体中的机制一直是个谜。有研究显示，过氧化物酶Pex5、Pex13和Pex14在PTS1（peroxisomal targeting signal 1）途径的蛋白质易位步骤中起关键作用。Pex5通过识别PTS1基序-羟基末端三肽序列丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸（SKL）或其变体与细胞质中的载体蛋白结合【2】。货物结合的构象变化暴露了一个固有的无序区域（intrinsically disordered region, IDR），该区域与过氧化物酶体膜蛋白Pex13【3-4】和Pex14【5-6】相互作用，导致货物蛋白易位到过氧化物酶体基质【7】。但到目前为止，在过氧化物酶体中从未观察到通道（孔隙）结构，也没有验证运输的物理模型。

2023年5月10日，来自加拿大蒙特利尔大学的Stephen W. Michnick团队在Nature杂志上在线发表了题为Peroxisome biogenesis initiated by protein phase separation的文章，研究人员发现，Pex13和Pex5中的IDRs类似于核孔复合蛋白中发现的区域，过氧化物酶体蛋白的转入取决于这些IDRs中芳香族残基的数量和模式。Pex13、Pex14和Pex5可以通过液-液相分离（LLPS）作用在过氧化物酶体上形成瞬态生物分子凝聚体，其可以作为通道将货物蛋白质转入过氧化物酶体。

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Pex5、Pex13和Pex14中IDRs的序列特征类似于核孔复合物的核孔蛋白的序列特征（图1a-b）。Pex13在其IDR中具有一系列Tyr-Gly（YG）重复。这些残基可能通过参与π-π或π-cation相互作用而发生LLPS，这些相互作用类似于Phe-Gly（FG）重复序列在核孔蛋白中形成的相互作用，这些核孔蛋白会经历LLPS并构成核孔复合物（NPC）的选择性渗透过滤器。作者假设由此产生的缩合物会形成一个简单的、原始的和瞬态的类似NPC的组件。该假设将为蛋白质导入过氧化物酶体提供解释：过氧化物酶通过LLPS形成生物分子凝聚体，并为货物运输穿过过氧化物酶体膜创建瞬态通道，Pex5充当类似于核转运蛋白的穿梭受体。酵母Pex13在其IDR中具有芳香重复序列，Pex5和Pex13在其IDR中具有朊病毒样结构域（PLD），已被证明通过多价π-π或π-阳离子相互作用形成生物分子缩合物【8-9】。因此，作者开始测试过氧化物酶体蛋白质转运通过Pex5-cargo-Pex13-Pex14 LLPS发生的假设。

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图1. Pex5和Pex13结构域序列特征分析。

首先，作者发现过氧化物酶体中蛋白质的导入与Pex13中的YG重复及Pex5-cargo水平相关。Pex5 PLD（aa150-190）富含极性氨基酸Ser（S）、Gln（Q）和Asn（N）（图1a）。相比之下，Pex13 PLD（aa76-142）含有高比例的 Y 和 G，形成 YG 重复结构域，由 S 或 N 隔断（图 1b）。为了研究过氧化物酶体蛋白导入是否与Pex13 YG重复有关，作者构建了mCherry-SKL作为模型载体蛋白，并对其进行体内过氧化物酶体摄取的可视化和定量分析。作者观察到将Y置换为S或F都会影响mCherry-SKL的转运，表明Pex13 PLD中的Y残基对PTS1蛋白转运至关重要。随后，作者设计了一种测定方法，通过瞬时表达PEX5 PTS1特异性转运蛋白基因来监测mCherry-SKL导入随时间变化的函数，从而监测mCherry-Pex5复合物的丰度。通过在PEX5基因上游引入诱导性pGAL1启动子（图2a），使细胞仅在含半乳糖的培养基中生长时，才允许Pex5表达和PTS1货物的转运。在WT细胞中半乳糖诱导后约30分钟可通过免疫印迹检测到Pex5信号（图2b）。mCherry-SKL的导入也在Pex5诱导后30分钟开始，超过90%的细胞显示mCherry-SKL焦点（foci），在1小时内与GFP-Pex13共定位（图2c-d）。mCherry-SKL foci以全有或全无的方式出现，然后强度持续增加（图2e），表明Pex5表达必须达到蛋白质导入发生的临界水平。进一步分析发现，过氧化物酶体中蛋白质的导入效率取决于Pex13中YG的排列模式。

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图2. a. 诱导型PEX5基因表达实验设计示意图；b.免疫印迹检测半乳糖诱导不同时间后PEX5的表达情况；c. Pex5诱导不同时间后，mCherry-SKL与Pex13的共定位分析。

接下来，作者表达并纯化了WT Pex13、Pex13（S8）、Pex13（S15）、Pex5和Pex14的IDRs，并通过在类似于使用核孔蛋白IDRs研究LLPS的相分离缓冲液中（20 mM Tris pH 7.4 containing 10% polyethylene glycol (PEG) 8000【15】）快速稀释浓缩的蛋白质储液来诱导LLPS。结果显示，WT-Pex13和Pex13（S8）IDR分别在10μM和30μM处形成球形液滴，而Pex13（S15）IDR即使在100μM处也不会形成液滴（图3a）。货物mCherry-SKL和Pex5转运蛋白是否可以在Pex13-IDR液滴中分配呢？作者将Pex5与mCherry-SKL一起孵育，然后引入Pex13 IDR。Pex5-mCherry-SKL复合物或单独的Pex5均可以被分配至WT-Pex13-IDR液滴中，而单独的mCherry-SKL则没有，提示Pex13-IDR凝聚体可以充当Pex5-cargo的转运通道。

最后，作者通过荧光交叉相关光谱成像（iFCCS）观察到了货物转入相关的过氧化物酶体膜发生的动态变化，并发现货物转入与过氧化物酶体膜上GFP-Pex13和GFP-Pex14的瞬态聚集有关，Pex13和Pex14在不同的时间范围内形成foci，表明它们可能在Pex5-cargo的不同饱和浓度下形成通道。

总的来说，该研究表明由Pex13、Pex14和Pex5组成的瞬态生物分子凝聚体可以作为蛋白质导入过氧化物酶体的通道。这些凝聚体的形成可以解释过氧化物酶体孔是如何根据需要形成和拆卸的，以转移不同尺寸的货物。作者提出了过氧化物酶体货物转运模型：如图3所示，在特定饱和浓度下，Pex5-cargo复合物通过其 IDR 之间的蛋白质-蛋白质相互作用与 Pex13 或 Pex14 发生相分离，形成凝聚体，为货物释放到过氧化物酶体腔中创造管道。人类过氧化物酶体输入机制的缺陷导致过氧化物酶体生物发生障碍，最严重的是齐薇格谱系障碍（Zellweger spectrum disorders）。在齐薇格谱系障碍患者中，已发现导致 Pex5、Pex13 和 Pex14 缺乏或完全缺失的突变，尽管IDRs有许多序列变异，但这些变异都不能致病，这也许是因为相分离对这种序列变化具有较强的兼容性。最后，作者认为，Pex13、Pex14和Pex5是广泛保守的，该研究提出的转运机制可能在真核生物中也是保守的。

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图3. 过氧化物酶体货物转运模型。

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06044-1

制版人：十一

参考文献

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2. Gatto, G. J. Jr, Geisbrecht, B. V., Gould, S. J. & Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5.Nat. Struct. Biol.7, 1091-1095 (2000).

3. Elgersma, Y. et al. The SH3 domain of the Saccharomyces cerevisiae peroxisomal membrane protein Pex13p functions as a docking site for Pex5p, a mobile receptor for the import PTS1-containing proteins.J. Cell Biol.135, 97-109 (1996).

4. Erdmann, R. & Blobel, G. Identification of Pex13p a peroxisomal membrane receptor for the PTS1 recognition factor.J. Cell Biol.135, 111-121 (1996).

5. Albertini, M. et al. Pex14p, a peroxisomal membrane protein binding both receptors of the two PTS-dependent import pathways.Cell89, 83-92 (1997).

6. Brocard, C., Lametschwandtner, G., Koudelka, R. & Hartig, A. Pex14p is a member of the protein linkage map of Pex5p.EMBO J.16, 5491-5500 (1997).

7. Francisco, T. et al. Protein transport into peroxisomes: knowns and unknowns. Bioessays https://doi.org/10.1002/bies.201700047 (2017).

8. Martin, E. W. et al. Valence and patterning of aromatic residues determine the phase behavior of prion-like domains.Science367, 694-699 (2020).

9. Wang, J. et al. A molecular grammar governing the driving forces for phase separation of prion-like RNA binding proteins.Cell174, 688-699 (2018).