CRISPR-Cas9系统自发现以来，已经被广泛应用于生命科学基础研究，遗传疾病基因治疗，动植物育种改良等领域。基于具有缺口酶活性的nCas9 (Cas9 nickase) 和腺苷/胞苷脱氨酶结构域结合的碱基编辑器可实现不依赖细胞复制周期的A-to-G，C-to-T和C-to-G的碱基替换【1-4】。最近，杨辉团队通过对糖基化酶（MPG）的改造，开发出了A-to-Y的腺嘌呤碱基编辑器（AYBE）和不依赖脱氨酶的鸟嘌呤碱基编辑器（gGBE），大大地拓展了碱基编辑的应用范围(填补领域技术空白，杨辉团队开发出不依赖脱氨酶的新型碱基编辑器；NBT｜杨辉团队开发出新型DNA碱基编辑器首次实现高效的腺嘌呤碱基颠换编辑)【5,6】。由于DNA碱基编辑不依赖双链断裂，具有更安全，更精准的特性，使得其在遗传疾病治疗中展现出了广阔的应用前景。然而由于Cas9的体积过大，基于nCas9的碱基编辑器难以实现单个AAV的包装递送，极大限制了在体基因编辑的发展应用。近年来，一系列Cas12f等小型高活性Cas蛋白被报道【7-11】，推动了基因编辑工具迈向了小型化时代，然而由于Cas12蛋白结构域组成的差异，难以被通过改造为nickase变体来开发适用于成体非分裂细胞的小型碱基编辑器。
张锋实验室通过重建CRISPR-Cas9系统的进化起源【12】，发现了由IS200/IS605转座子超家族中一类核酸酶IscB，其被认为是Cas9蛋白的远古祖先，与Cas9蛋白具有相似的结构域组成（Science | 张锋团队：源于IS200/605转座子家族的多种核酸酶或可成为基因编辑新工具）。有趣的是，IscB蛋白的大小只有约500个氨基酸，不到SpCas9的2/5。IscB被证明可通过ωRNA引导，实现对双链DNA靶位点的特异性的切割。在对近100个野生型IscB蛋白进行功能筛选后，只有OgeuIscB蛋白被报道在哺乳动物细胞内存在微弱的编辑活性，这意味着历经数十亿年的进化，Cas9的酶活已远高于其祖先IscB，而IscB是否可以通过定向进化实现和Cas9相当的活性是未知的。
2023年5月25日，辉大（上海）生物科技有限公司研发团队和中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（中科院神经所）杨辉团队在Nature Methods上发表题为Development of miniature base editors using engineered IscB nickase的研究论文。该研究综合了RNA结构优化，蛋白质改造工程，流式细胞术，全基因组脱靶检测等技术手段，对IscB系统进行了大量优化和改造，成功获得了在人类细胞内具有高效编辑活性的IscB变体（enIscB）。通过融合腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶结构域，开发出了高活性的迷你型单碱基编辑器miABE和miCBE。该研究将进一步推动了DNA单碱基编辑领域进入迷你型的“新时代”。
之前的研究表明向导RNA对编辑工具的活性具有一定的影响，因此研究者结合已报道的ωRNA结构【13,14】，在ωRNA四个区域内分别进行优化，利用高通量真核细胞报告系统筛选后，得到了高活性ωRNA变体。为了进一步提高编辑活性，研究人员将IscB蛋白的氨基酸依次替换为精氨酸（R），从而筛选得到提高编辑效率的一系列突变位点，最终开发得到了高活性IscB系统enIscB。
此外，他们将enIscB与T5外切酶融合表达，发现在HEK293细胞中多个位点可以实现与SpG Cas9相当的切割效率。PEM-seq脱靶分析也证明，融合T5外切酶后enIscB造成的染色体易位水平在多个位点平均降低了5.43倍。
在此基础上，研究人员将IscB的 RuvC和HNH结构域的区域关键催化位点的氨基酸替换为丙氨酸（A），利用报告系统筛选得到的D61A变体具有最高的切口酶活性，将该变体分别与腺苷脱氨酶（TadA8eV106W），胞苷脱氨酶（APOBEC3AW104A）和尿嘧啶糖基化酶抑制子（UGI）融合表达，通过不同的结构组合筛选，研究者确定了最优的ABE和CBE结构，分别命名为miABE和miCBE。多个真核细胞内进行内源位点的验证也表明它们具有高效的（最高达92%）的编辑效率，展现出巨大的应用潜力。
总的来说，该研究基于IscB优化改造，开发出高活性迷你型碱基编辑工具，将有望解决现有基因编辑工具过大带来的递送难题，极大地推动在体基因编辑的应用与发展，尤其是使得通过单个AAV递送CBE或GBE成为可能。进一步拓宽基因编辑的应用场景，加速基础科学研究和基因治疗的发展。
中科院脑科学与智能技术卓越创新中心博士研究生韩鼎毅，王一凡，辉大基因创新研究院博士后肖庆全，张海南博士为该论文的共同第一作者。辉大基因创新研究院执行院长周英思博士和辉大基因创始人&首席科学顾问杨辉博士为该论文的通讯作者。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41592-023-01898-9
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