撰文丨WK红叶
我们的肠道微生物，也称为肠道菌群，影响的远不止消化系统。肠道中的细菌会影响大脑活动--甚至具有引起精神疾病的可能。数十年的研究表明，肠道细菌失衡可以破坏人体的许多系统，从而导致肥胖、营养不良甚至癌症。
近日，来自加州大学戴维斯分校、斯坦福大学和Envivo Bio公司等单位的研究人员研发了一种基于pH值变化的肠内容物无创采样胶囊（CapScan），可在人体不同肠段收集微生物及代谢物样本。该成果以：Profiling the human intestinal environment under physiological conditions 为题发表在了国际顶尖学术期刊Nature上。
基于CapScan这一新方法，研究团队还于同一天在Nature Metabolism期刊发表了题为：Human metabolome variation along the upper intestinal tract 的论文。
该研究证实了健康人上段肠道与粪便的代谢物之间存在显著差异，为深入理解肠道不同区段的微生物及代谢物在人类生理或病理过程中的作用提供了新方法和新证据。
Capscan胶囊图像，图源：Envivo Bio公司
人类小肠的菌群一直很难捕获，尤其与收集粪便样本的便利性相比，这是研究人员研究人类肠道菌群的传统方法之一。进行内窥镜手术或尸体解剖时，可能存在从胃或其他附近器官产生的污染，这可能会影响到样本的质量，使其无法准确地代表肠道中的活体菌群。
CapScan胶囊可以很好地克服上述不足，科学家首次在人类中测量了小肠微环境，捕获了小肠的更细微视图，显示出器官的不同区域孕育着不同的细菌。研究人员可选择感兴趣的区域进行取样和研究，首次全景式地展现肠道代谢物及其与微生物互作的相关信息。
其他非侵入性的可摄取设备已被设计用于猪和灵长类动物的肠道样本采集，最早的设备开发于2019年。CapScan胶囊其大小约为一颗药丸，可在人体中使用，并且可以采样比以前的设备大四倍的体积，捕获小肠不同部位的微生物。这种胶囊是空心的（好处是能够在预定的时间间隔内打开，从而在肠道的不同部位收集样本）。
同时，区别于传统的胶囊，其他一些胶囊可能装有电子设备，比如传感器、电池、通讯模块等，这些设计可能使得制造过程更复杂，成本更高，从而限制了这些胶囊的广泛使用。然而，新设计的胶囊是空心的，简单得多，没有复杂的电子设备，因此更易制造，成本更低，更适合大规模使用。
视频：针对空肠和升结肠的设备被连接到胶囊内窥镜上，使得能在人体参与者内部进行成功的取样，并实现取样过程的可视化，来源：Nature
采样胶囊的制作原理及实验设计
CapScan采样胶囊由Envivo Bio公司研发，其内部有一个折叠的收集囊，囊外包裹着一层pH敏感的肠溶衣。肠道的pH变化有一定规律，从十二指肠（pH：4-6）到回肠（pH：7-8）逐渐上升，末端回肠及以后又开始下降。当达到特定的pH值后，肠溶衣溶解，收集囊随之膨胀并通过单向阀吸入肠腔液体，每个胶囊可收集400ul的内容物，当液体满了之后阀门关闭防止交叉污染，最后胶囊从粪便中回收，可用于后续的多组学分析。该装置实现了在不同肠段、不干扰局部微生物的情况下纵向收集肠道内标本。
接下来，研究者对15名健康受试者进行了系列研究，连续2天餐后3h吞服4个采样胶囊，同时收集受试者的唾液和粪便样本。其中1号到3号胶囊收集小肠内容物，4号胶囊收集升结肠内容物。最终收集了29份唾液样本、59份粪便标本以及218份采样胶囊，随后进行微生物组、宏基因组、病毒组、蛋白组及代谢组的分析及比较。
肠道微生物组在空间分布上存在差异
首先，作者通过PCoA分析显示唾液样本与肠道及粪便样本显著分离，表明口腔微生物组与肠道内容物的组成存在显著差异；既往服用过抗生素的受试者其肠段微生物组成与粪便样本类似；所有受试者肠道中23%±10%扩增子序列变体 （ASV，代表物种） 未在对应的唾液或粪便中检测到；同样，粪便中12%±8% ASVs未在其肠道样本中检测到。此外，肠道中变形菌门的丰度要高于粪便，这与以前报道一致；另发现四种ASVs（分别来自埃希菌属/志贺菌属、肠球菌属、拟杆菌属和罗姆布茨菌属）其肠道内含量明显高于粪便中含量。
接下来通过与粪便或唾液样本相比，作者发现个体肠道样本中的微生物群变异性更大，说明了采样胶囊所收集样本的确来自于不同的肠段环境。虽然1~4号采样胶囊是对肠道不同区段进行纵向取样，但同一标号的胶囊在不同时间吞下后，所收集的样本中的微生物群组成仍会受到饮食、神经激素变化、肠道运动、pH值和/或肠道微生物群本身变化所影响。对其中一位受试者研究发现，在同一时间吞食某标号的胶囊比在不同时间吞入对应标号的胶囊含有更多相似的微生物群落。此外，作者证实肠道样本通常由单一的ASV主导，其相对丰度>40%，这与唾液和粪便样本不同，表明个体肠道样本的α多样性更低。综上，肠道样本相对于粪便样本具有较高的变异性，推测可能是由于肠道微生物群的动态变化及异质性造成的。
胶囊内的微生物仍具活力
取部分采样胶囊的样液进行体外培养，4h后有20-50%的细胞恢复了生长；值得注意的是，新鲜粪便的重悬液在厌氧环境中培养也表现出了类似的细胞再生现象，说明采样胶囊对活菌的保存程度与新鲜粪便是相当的。此外，细胞的生长表现出广泛的形态，提示重新生长并不偏向少数菌群。通过延时成像，发现了类似人类上皮细胞的生长（约占总细胞数的0.1%），这与样本中的一小部分宏基因组reads数映射到人类基因组相一致。故而采样胶囊内的样本能够进行培养组学实验，并为研究肠腔内的宿主细胞提供可能性。
肠道样本比粪便样本更容易诱导原噬菌体
根据宏基因组测序结果作者进一步研究肠道病毒群组：共发现1607个病毒的操作分类单元（vOTUs），其中83%（1343/1607）在肠道和粪便标本中均可检测到，说明肠道与粪便的病毒组成分类似，且通过reads映射的vOTUs丰度在肠道和粪便样本之间通常是相关的；而与来自不同受试者的粪便或肠道标本相比，同一受试者其粪便和肠道标本的病毒组也更相似；此外，病毒组的PCoA结果与细菌群呈现类似的分布。值得注意的是，绝大多数受试者粪便和肠道中诱导的原噬菌体存在显著差异，肠道诱导的数量显著高于粪便诱导的；绝大多数粪便中诱导的原噬菌体（61/71）亦可在肠道中诱导，但肠道中诱导的原噬菌体（161/222）在粪便中未观测到。不同pH的肠段能诱导不同数目的原噬菌体。综上，肠道环境有利于原噬菌体的诱导，这一结果突出了肠原位采样对噬菌体动力学的研究具有重要意义。
肠道中的宿主蛋白与粪便存在差异
接下来，作者通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）来定量研究肠道与粪便样本中的人类蛋白。每个样本分析了2276±269个人类蛋白，其中肠道样本部分高丰度蛋白与粪便样本的存在显著差异，并找到了一些能够代表肠道和粪便的差异蛋白。相关分析显示：粪便样本中的宿主蛋白质组在个体间的变化比个体内的变化更大，而在肠道样本中个体间的变化与个体内的变化相似，这表明粪便样本中的蛋白存在广泛分离。通过比较宿主蛋白质组的皮尔逊相关系数和配对样品微生物群组的Canberra距离，发现相关性更高的蛋白组样本，同样具有相关性更高的配对菌群。由此得到结论：粪便的宿主蛋白不能代表肠道中的宿主蛋白，此外宿主蛋白质组与肠道微生物群密切相关。
肠道胆汁酸分布与粪便明显不同
胆汁酸对于食物消化、脂质吸收等具有重要作用，大约95%的胆汁酸在回肠远端被上皮细胞吸收通过门静脉进入肝脏，并被重新转化回胆汁酸盐再次分泌。作者对17种已知的胆汁酸进行了靶向LC-MS/MS代谢组学分析和多重反应监测。在肠道样本中胆汁酸总浓度和相对水平存在较大差异：与1号胶囊相比，4号胶囊的总胆汁酸浓度减少了2倍，至于粪便则减少了10倍，说明胆汁酸沿肠段不断被吸收。近期使用抗生素的受试者其肠道胆汁酸谱与粪便样本较为相似，且肠道和粪便样本均缺乏脱氧胆酸和石胆酸，推测提供7α-脱羟基反应以合成这些胆汁酸的微生物可能被抗生素去除。总体来看，胆汁酸的相对水平和主要类别在肠道和粪便样本中都存在明显差异。其中，肠道样本主要以初级胆汁酸为主，粪便样本则以次级胆汁酸为主，说明基于粪便的研究并不能反映肠道中的胆汁酸谱的真实情况。
肠道内胆汁酸的梯度修饰
胆汁酸可被肠道微生物酶修饰，其中胆汁盐水解酶（BSHs）可以完成甘氨酸或牛磺酸解聚。虽然肠道和粪便样本的BSH基因丰度差异很小，但1~4号胶囊样本中所检测到的肝脏结合胆汁酸水平依次下降，提示沿着肠道不断发生结合胆汁酸的去结合过程。脱羟基反应可将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸，既往研究认为该过程主要发生在低氧化还原状态的结肠中。本研究结果与之一致，其中各部位采样胶囊获取样本的次级胆汁酸水平无显著差异，但粪便样本的水平显著增加，并以次级非结合胆汁酸为主。综上，胆汁酸谱的变化表明了微生物活性及肠道生理环境具有区域性，进一步证实依靠粪便进行微生物组和胆汁酸的研究存在较大局限。
肠道微生物与胆汁酸去结合的关联
由于肠道样本中结合胆汁酸浓度依次降低，故作者推测发挥去结合修饰作用的微生物种群与结合胆汁酸浓度呈负相关。首先研究的是初级结合胆汁酸中的甘氨胆酸（GCA）和牛磺胆酸（TCA），二者在1-4号胶囊中的浓度依次递减，粪便中最少。其中GCA浓度与Anaerostipes hadrus及Faecalibacterium prausnitzii负相关；TCA的浓度与Alistipes putredinis 和 B. wadsworthia 负相关。此外，还观察到牛磺鹅脱氧胆酸浓度与 B. wadsworthia 和 A. putredinis 负相关，牛磺脱氧胆酸与 A. putredinis 负相关，表明肠道内这些菌种与各牛磺酸结合的胆汁酸相互作用。然而粪便样本中 B. wadsworthia 和 A. putredinis 的相对丰度与TCA浓度关联很弱。由此可见，肠道内微生物与胆汁酸修饰密切相关，但粪便微生物与之相关性不显著。
与胆汁酸特异性结合的氨基酸
近期发现除了甘氨酸和牛磺酸，还有一些氨基酸（如TyroCA、LeuCA、PhenylCA）可与胆汁酸结合，而肠道微生物可体外合成上述氨基酸。但很少有研究报道宿主肠道中这些微生物相关的结合胆汁酸其纵向变化趋势。 研究者们使用了LC-MS/MS分析，并采用数据依赖的MS/MS采集方法，在所有参与者的肠道样本中检测到了22种微生物结合的胆汁酸，这些胆汁酸以各种羟基化形式存在于13种氨基酸中。与粪便样本相比，这些微生物结合的胆汁酸在肠道样本中的浓度明显更高，且占胆汁酸总量的比例也明显更高。
此外在肠道样本中，初级肝脏结合胆汁酸和次级肝脏结合胆汁酸二者浓度显著相关，而微生物相关的结合胆汁酸浓度与去结合胆汁酸浓度相关。而在粪便样本中，微生物相关的结合胆汁酸浓度与初级去结合胆汁酸的浓度相关，并与次级去结合胆汁酸负相关。该结论说明肠段区域对结合胆汁酸浓度（无论是肝脏结合胆汁酸还是微生物相关的结合胆汁酸）影响很大，也说明了肠道与粪便存在代谢环境的差异。
在肠道样本中发现了22个微生物相关的结合胆汁酸，其中20个在粪便样本亦可检测到，但浓度更低；不同采集部位的胶囊中，微生物相关的结合胆汁酸也表现出不同的梯度，其中1~4号胶囊中谷氨酰胺结合的胆汁酸浓度依次增加，与非结合的次级胆汁酸变化趋势一致；然而，丝氨酸结合的胆汁酸的浓度都有所下降，这与肝脏结合的胆汁酸的变化趋势相似。综上，作者提供了在人体肠道中对微生物相关的结合胆汁酸的空间研究方法，并且发现了微生物结合胆汁酸具有氨基酸特异性。
总结
目前对肠道微生物组、蛋白质组和代谢组的研究多来源于粪便标本的分析结果，然而粪便样本不能反应肠道不同区段的情况，且绝大多数代谢物在肠道上段中合成、转化及利用。因受限于取材方法，我们对肠道上段的微生物组成、生物合成及代谢情况知之甚少。本研究开创了一种可在肠道不同部位进行取样的新型胶囊，通过多组学分析在健康人群中首次证实了：粪便样本与肠道样本中的细菌、噬菌体、宿主蛋白和代谢物存在显著差异，为进一步阐明人体生理或病理状态下肠道微生态所发挥的作用提供了新方法和新证据。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-05989-7
https://www.nature.com/articles/s42255-023-00777-z
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