Sci Transl Med：慢性疼痛的基因治疗——新思路新希望！|受体|基因治疗|慢性疼痛|炎症|神经元|脊髓

阿片药物危机催生了非成瘾性疼痛治疗需求。近日，来自牛津大学David Bennett团队，由Jimena Perez-Sanchez和Steven J. Middleton等人研究评估了直接抑制感觉神经元中与疼痛相关的过度活跃是否可能是种有针对性的疼痛治疗策略。结果显示，PSAM4-GlyR激活抑制感觉神经元，改善小鼠严重疼痛、炎症和神经性疼痛行为。虽需人体验证，但暗示了PSAM4-GlyR在基因治疗疼痛中的潜力。

他们的成果发表在最新一期的Science Translational Medicine杂志上，名为“A humanized chemogenetic system inhibits murine pain-related behavior and hyperactivity in human sensory neurons”

慢性疼痛是医学难题，影响大量患者。感觉神经元活性增加是炎症和神经性疼痛的主要原因。当前已有一些研究追求化学遗传学方法，通过调节特定受体来控制神经元活动，可能提供潜在治疗选择。最新的pharmacologically selective actuator modules具有广泛前景，它是基于改进的人类ɑ7烟碱乙酰胆碱（ACh）受体配体结合结构域，不再结合ACh，而是超强药理选择效应分子（uPSEMs）。PSAM最新版本获得FDA批准，使用varenicline药物，与人类甘氨酸受体孔域结合，形成PSAM4-GlyR，激活氯化物通道。

1.生成新的PSAM4-GlyR结构

作者对PSAM4-GlyR结构进行改进，并确保其适合包装成AAV载体，以进行体内输送。最有潜力的结构为pCAG-mCherry-tPT2A-PSAM4-GlyR（mCherry-T-PSAM4-GlyR）。在HEK（人类胚胎肾脏） 293T细胞中评估其表达和功能，通过全细胞膜片钳记录测量添加varenicline后的膜电导率。结果表明mCherry-T-PSAM4-GlyR功能正常，且varenicline应用后膜电导率显著增加，与原始结构相似。因此，作者选择mCherry-T-PSAM4-GlyR（及仅使用mCherry作为控制组）进行后续实验（图1A）。

2.PSAM4-GlyR的激活使小鼠感觉神经元的电活动沉默，并抑制dorsal horn neurons的传播

为了评估PSAM4-GlyR在感觉神经元中作为化学遗传“消音器”的适用性，作者转染了DRG感觉神经元，使用mCherry-alone或mCherry-T-PSAM4-GlyR结构（图1b）。在实验中，他们选择了20 nM varenicline作为最佳激活浓度。这些激动剂导致了膜电导率的增加和膜电位去极化（图1c-e）。在PSAM4-GlyR神经元中，激动剂给药增加了在其表达神经元中产生动作电位所需的电流，但在控制神经元中没有产生AP（图1G）。激动剂有效地沉默了感觉神经元，降低了输入电阻，并增加了基强度（图1l）。所有这些效应在15分钟的激动剂冲洗后都可逆转。这些结果表明，PSAM4-GlyR通过大规模氯离子通路，有力、有效且可逆地抑制感觉神经元活动。

为验证神经元活动在脊髓突触前末端的有效沉默，作者测量了突触传输。他们记录dorsal horn neurons的电活动，并测量ePSCs引起的单突触兴奋性突触后电流（图1，M和N）。结果显示，感觉神经元的电活动沉默影响了信息传递到脊髓（图1，O和P）。

图1. PSAM4-GlyR可以可逆地使小鼠感觉神经元安静下来，并减少突触传递

3.PSAM4-GlyR的激活导致热和机械灵敏度降低

作者验证了体内外PSAM4-GlyR激活对神经元的抑制作用。通过鞘内注射PSAM4-GlyR病毒载体，有选择地作用于DRG感觉神经元，而不影响脊髓神经元。经过6至8周处理后，检测热敏感性。随后，腹腔内注射uPSEM792（1毫克/千克）产生短期热敏感性降低，而更高剂量的uPSEM792（5毫克/千克）可导致持久效果。长期测试表明PSAM4-GlyR表达和功能稳定，并通过varenicline可逆地影响感官行为（图。2，G到K）。

图2.通过激动剂诱导的PSAM4-GlyR激活，对敏锐的感官行为进行稳健、可逆和可重复的沉默

4.PSAM4-GlyR在DRG感觉神经元中的稳定表达

经行行为实验验证PSAM4-GlyR的鞘内病毒输送后长期表达。不偏向任何类型的感觉神经元，50%的L4 DRG神经元未表现mCherry荧光信号（图3B）。AAV9-mCherry-T-PSAM4-GlyR选择性地转导DRG神经元亚群，不同亚群表达相近，但酪氨酸羟化酶亚群表达较低。PSAM4-GlyR广泛分布于脊髓表层和深层，未观察到脊髓神经元表达mCherry-T-PSAM4-GlyR（图3I）。ATF3未增加，表明长期PSAM4-GlyR表达与神经元损伤无关。结果表明，PSAM4-GlyR鞘内输送有效地选择性地转导DRG神经元，并在数月内保持稳定。

图3. AAV9-mCherry-T-PSAM4-GlyR在感觉神经元中选择性表达的长期稳定

5.PSAM4-GlyR介导的在两种炎症性疼痛模型中抑制疼痛相关行为

炎症或伤害后，痛觉受体变得敏感，引发疼痛。作者研究了沉默系统在病理性疼痛中的应用。首先，采用炎症性疼痛模型，注射福尔马林至小鼠爪，其中一组表达PSAM4-GlyR。结果显示，PSAM4-GlyR小鼠表现出较少疼痛行为。进一步在炎症性关节疼痛模型中验证，PSAM4-GlyR沉默可减轻机械超敏，可通过药物美洛昔康或Varenicline实现。数据暗示，PSAM4-GlyR沉默可减轻炎症引起的疼痛行为（图4B-H）。

图4. PSAM4-GlyR介导的炎症性关节和神经性疼痛的沉默

6.PSAM4-GlyR的激活抑制了人类衍生感觉神经元的兴奋性

作者验证了PSAM4-GlyR在动物模型中的有效性，现在将其扩展到人类hiPSC-SNs。通过病毒表达，成功将PSAM4-GlyR引入hiPSC-SNs中，观察到其在神经元兴奋性上的调控效果（图5A-J)。PSAM4-GlyR激活也可以在人类感觉神经元模型中抑制神经元活动，验证其作为潜在基因治疗工具的重要性。