研究背景
儿童低级别胶质瘤（pLGG）是最常见的儿童中枢神经系统（CNS）肿瘤之一。尽管 10 年和20年总生存率（OS）分别为87%和82%， 但10年无进展生存率（PFS）仅为58%。首选的治疗方法是手术切除，其他标准治疗方法（SOC）包括化疗（卡铂+长春新碱/长春地辛）和放疗。pLGG被认为是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路改变所引起的，最常见的改变为KIAA1549：BRAF融合、BRAFV600E突变、FGFR1突变和NF1突变。因此，MAPK通路的抑制剂，如MEK抑制剂（司美替尼、曲美替尼和比美替尼）以及BRAF抑制剂（达拉非尼和维莫非尼）在临床试验中取得了令人鼓舞的结果。上述药物的客观缓解率是30-54%。然而，与化疗一样，这些药物经常产生副作用，导致治疗停止，停药后肿瘤反弹。
MAPK通路包括三个核心节点：BRAF、MEK和ERK。ERK是该通路的枢纽，有150多个细胞膜和细胞核下游磷酸化靶点。ERK还参与负反馈调节，在RAF水平上调节MAPK通路，可能在BRAF抑制剂或MEK抑制剂间接抑制后使MAPK通路重新激活。因此，直接靶向ERK是治疗MAPK通路异常的肿瘤的一种新颖的和有前景的方法。
优立替尼（ulixertinib，BVD523）是一种可逆的、ATP竞争性的ERK1/2抑制剂，与BRAF抑制剂联合用于BRAF突变的黑色素瘤模型时，已显示出协同抗肿瘤作用。本研究评估了优立替尼单药或与MEK抑制剂、BH3模拟物（诱导体外pLGG细胞衰老）及化疗联合应用，对BRAF突变的pLGG的治疗潜力。
研究方法
1、细胞培养
在增殖和衰老模式下培养毛细胞星形细胞瘤细胞系（DKFZ-BT66；存在KIAA1549:BRAF融合）和多形性黄色星形细胞瘤细胞株（BT40；存在BRAFV600E突变和CDKN2A缺失）。
2、药代动力学研究及体内临床前研究
向小鼠注射BT40细胞，并通过IVIS验证肿瘤生长情况。单一剂量组（n=28）小鼠口服优立替尼80mg/kg（每25克小鼠口服0.25ml优立替尼）。多剂量组（n=28）连续五天每天给药两次（每12小时一次）。药代动力学研究在最后一次注射后持续24小时。
将BT40细胞原位移植至48只NSG小鼠体内，肿瘤生长2周后将小鼠分配至以下治疗组：A：Navitoclax单药；B：优立替尼+ Navitoclax；C：优立替尼+长春新碱；D：载体；E：长春新碱单药；F：优立替尼单药。治疗自分组后3天开始，持续19天。每2周进行一次发光成像观察。
统计图标和分析
图1：优立替尼在BRAFV600E突变和KIAA1549：BRAF融合pLGG细胞系中的体外活性。A、B、C分别为BT40、DKFZBT66_ON和DKFZBT66_OFF中测得的IC50代谢活性；D、E、F分别为在BT40、DKFZBT66_ON和DKFZBT66_OFF中测得的MAPK的IC50活性。(G）来自GDSC数据库的IC50和BT40的IC50的汇总。（H）描述优立替尼在GDSC数据集中所有胰腺癌细胞系中IC50的箱形图。（I）箱形图显示了仅来自GDSC的数据
图2：优立替尼与MEK抑制剂、BH3模拟物或化疗药物联用的协同作用分析和靶向活性。 A-F环形热图总结了测试组合的协同作用结果。最外圈：每种药物的协同作用得分；中间圈：矩阵设计得出的平均协同作用得分；最内圈：矩阵设计得出的组合敏感性得分。G：各类药物在不同协同作用指标和不同药物之间的一致排名。H：基于ERK下游级联的微型信号网络（直接下游靶点：STAT3、P90RSK、RSK；核靶点：CREB、MSK1：CREB、MSK1；下游调控蛋白：DUSP6）。图中显示了相对于DMSO对照，处理细胞中蛋白质磷酸化折叠变化。
图3：通过高通量显微镜验证各组合的协同效应结果。最外圈：协同作用得分；最内圈：组合敏感性得分。NA，协同作用计算不适用。K：A-J的一致排名。
图4：斑马鱼验证。A：用于评估优立替尼、比美替尼、Navitoclax和DMSO治疗72h后毒性的代表性示例图片。MTD：最大耐受剂量；LD：致死剂量。B：斑马鱼胚胎肿瘤移植示例图片。刻度线代表100微米。C：热图显示斑马鱼根据RECIST1.1采用的进展性疾病（PD）与部分缓解（PR）的比率，使用log10转换值。S：溶剂；D：相关药物；U：优立替尼；C：和相关药物的组合。比美替尼（B）或Navitoclax（N）
图5：优立替尼在体内的药代动力学数据和临床前评估。A：两个给药组别（单剂量和多剂量组）第1-7组的血液采集情况。关键时间点定义为0.5-24小时（用粗体表示）。每只小鼠进行了三次血液采集和一次额外的心脏穿刺末端采集。B-C：优立替尼药代动力学实验的研究设计。D：单剂量和多剂量组群的优立替尼血浆和脑浓度。E：研究设计时间表。F：治疗小鼠的生物发光图像。动物每周成像两次，直至达到终止标准。生物发光信号显示为平均辐射度，范围为1.0E6-1.0E8光子/秒/平方厘米/昼夜。G：对所有接受治疗的动物进KaplanMeier存活率分析（每组8只）。
结果
1、优立替尼在BRAFV600E突变型和KIAA1549：BRAF融合细胞系中可以达到具有临床活性的浓度
为了研究优立替尼的体外抗肿瘤活性，研究者使用了BRAFV600E突变模型和KIAA1549：BRAF融合模型DKFZBT66。在BT40中，优立替尼在临床可达到的浓度下降低了代谢活性，IC50为62.7nM（图1A）。优立替尼不影响DKFZBT66增殖细胞（图1B）或衰老细胞（图1C）的代谢活性，这与之前观察到的各种MAPK抑制剂一样。这些数据表明优立替尼在BRAFV600E突变和KIAA1549：BRAF融合的pLGG细胞中存在临床活性。
2、优立替尼与MEK抑制剂或BH3模拟物在体外具有协同作用
研究者探索了优立替尼与MEK抑制剂（比美替尼、司美替尼、曲美替尼）、BH3模拟物（A1331852、Navitoclax、Venetoclax）和标准化疗（卡铂+长春新碱）联合使用的潜在抗肿瘤作用。除Venetoclax和卡铂外，所有单药的代谢IC50 都达到了临床可达到的浓度。
在BRAFV600E突变模型中，优立替尼联合曲美替尼、比美替尼或A1331852显示出协同作用或加成作用（图2A）。还观察到了与比美替尼联用时的同步交互作用（图 2B）。在增殖的KIAA1549：BRAF融合模型中，优立替尼与BH3模拟物联用具有协同作用。与Venetoclax的协同作用得分最高，但其浓度高于临床可达到的水平。与化疗药物联合时显示出整体缓冲拮抗作用（图2C）。与比美替尼和曲美替尼的组合显示出很强的协同作用，而与司美替尼的组合则显示出缓冲拮抗作用（图2D）。在衰老的KIAA1549：BRAF融合模型中，优立替尼与BH3模拟物的组合显示出协同作用，与Navitoclax或A1331852联合时效果最佳（图2E）。与比美替尼和曲美替尼的协同作用得分最高（图2F）。
根据协同作用得分排序最终确定MEK抑制剂比美替尼和曲美替尼以及BH3模拟物Navitoclax和A1331852为优立替尼的最佳联合药物。（图2G）。化疗药物中与优立替尼联合的最佳药物为长春新碱。另外，由于A1331852目前尚未进行临床评估故被排除。
通过RPPA和Western印迹对几个ERK下游靶点进行了研究（图2H），可发现优立替尼处理后的样本出现ERK靶点磷酸化，并且在所有组合中都观察到了优立替尼的剂量依赖性效应。因此所有研究组合都具有靶向活性。
3、验证比美替尼和Navitoclax与优立替尼在体外/体内可有效协同
在BT40细胞中，单独应用优立替尼、MEK抑制剂、Navitoclax和长春新碱会减少细胞数量，抑制细胞活性。与单独应用曲美替尼、比美替尼和Navitoclax相比，联合应用Navitoclax及优立替尼时观察到最强的诱导细胞凋亡效应。在优立替尼与比美替尼、司美替尼和长春新碱的组合中测定了细胞增殖和活力（图3A-B）的协同作用得分。其中优立替尼与比美替尼或Navitoclax的组合对细胞死亡有协同作用（图3C）。优立替尼与比美替尼、曲美替尼、Navitoclax和长春新碱的组合可协同诱导细胞凋亡（图3D）。
在DKFZ-BT66细胞中，无论是增殖细胞和衰老细胞中测试的所有组合中都发现了拮抗增殖和缩小细胞体积的效应（图3E-H）。但对诱导细胞死亡的效应充其量是相加的（图3I-J）。根据协同作用得分对所有药物进行排序，发现比美替尼、Navitoclax 和长春新碱是优立替尼的最佳联合药物（图3K）。
迄今为止，斑马鱼胚胎模型是研究体内pLGG细胞衰老的唯一选择。用优立替尼处理未注射的斑马鱼胚胎以确定各自的最大耐受剂量（MTD）和致死剂量（LD）（图4A）。斑马鱼胚胎对优立替尼的最大耐受剂量为2.5µM。根据进展性疾病与部分反应（PD/PR）的比率评估了pLGG异种移植瘤在治疗后的生长情况（图4B）。只有在增殖的DKFZBT66_ON异种移植瘤中，优立替尼的PD/PR比值才小于1.0（图4C）。在所有其他模型中，只有联合治疗才能达到这种效果，且疗效大大增加。在所有三个模型中，pLGG与Navitoclax联合治疗的PR率均优于与比美替尼联合治疗的PR率（BT40：54% vs. 33%；DKFZ-BT66_ON：67% vs. 36%；DKFZ-BT66_OFF：23% vs. 22%）。这些数据确定了Navitoclax与优立替尼联用是抑制BRAF驱动的pLGG肿瘤生长的有前景的组合，有待在体内进一步验证。
4、优立替尼在小鼠体内的毒性、药代动力学和药效学研究
用优立替尼对NSG小鼠进行每天两次、连续五天的治疗不会导致体重下降，平均体重变化为-1.67±5.84%，而体重下降是毒性的替代指标。药代动力学研究在BT40异种移植（PDX）小鼠中进行。在单剂量和多剂量组中的24h时间窗内进行采样（图5A-C）。使用健康大脑和肿瘤区域（肿瘤、小脑、皮层/其他脑区）的组织匀浆测定脑内的总优立替尼浓度（图5D）。肿瘤脑组织和健康脑组织的优立替尼浓度是相当的。优立替尼对血脑屏障的穿透率较低，与血浆相比，其脑内浓度仅为1.76%。尽管如此，在两个队列中，优立替尼的脑部总浓度在用药后的最初12小时内均超过了有效的体外IC50浓度（30.4ng/g）。因此，脑部潜在有效浓度在稳态时就已达到。为了验证这一点，研究者通过WesternBlot法对两个治疗组的健康脑组织和肿瘤脑组织中的优立替尼体内靶向活性进行了研究。优立替尼对DUSP6蛋白的抑制具有时间依赖性。与测得的总药物组织浓度相关。恶性脑组织与健康脑组织之间无差异。
5、优立替尼对小鼠pLGG模型的体内抗肿瘤疗效
移植后2周开始使用前述药物治疗，优立替尼在PDX小鼠模型中表现出显著的抗肿瘤活性（图5F），并减缓了肿瘤的生长（P=0.0019），优立替尼治疗小鼠的中位生存期为48.5天，而接受载体的小鼠为30天（图5G）。Navitoclax或长春新碱与优立替尼联合治疗都不能显著改善疗效（图5G）。研究者测量了肿瘤组织中的Navitoclax浓度，发现只有Navitoclax单药治疗组的3/6只小鼠和联合治疗组的1/6只小鼠的肿瘤组织浓度高于体外Navitoclax有效浓度IC50以上，这可能是联合使用Navitoclax治疗的疗效较低的原因。值得注意的是，在抑制肿瘤生长方面，优立替尼的表现优于化疗（长春新碱）（图5G）。然而，在治疗结束后，所有幸存者的肿瘤生长都加快了，这凸显了优立替尼的细胞抑制活性（图5F）。虽然所有治疗方案的耐受性都很好，但一些接受Navitoclax或长春新碱治疗的小鼠出现了轻微的体重减轻（<20%），这与脑肿瘤相关症状无关。
新型候选药物的临床前研究是开展新临床研究的必要前提。临床前研究可以评估药物的临床潜力，并且预测潜在的不良反应。本研究是首次对第一代ERK抑制剂优立替尼在BRAF驱动的pLGG模型的抗肿瘤活性进行的临床前研究。该药在BRAFV600E突变（BT40）模型中显示出显著的有效性，在BRAF融合模型中，优立替尼对MAPK通路也表现出了相当的抑制效应，包括DKFZBT66_ON（可反映进展风险高的患者）和DKFZBT66_OFF（可反映进展风险低的患者）。在增殖和衰老模型中也观察到明显的MAPK抑制效应，说明优立替尼可能对稳定和进展型的pLGG具有同样的疗效。此外，优立替尼在临床可达到的浓度下具有很强的药效，另外没有观察到与ERK相关的负反馈环抑制导致MAPK激活的矛盾现象。
体内研究证实，优立替尼在有效浓度下具有良好的耐受性，其药代动力学特征与之前公布的人体I期药代动力学数据一致。本研究证明了优立替尼在脑组织的浓度足以诱导MAPK通路抑制，这与优立替尼之前在多形性胶质母细胞瘤和脑转移瘤临床试验中证明的中枢神经系统活性一致。优立替尼在健康组织和肿瘤组织中的分布情况相似。其浓度高于体外IC50，其对MAPK通路替代标记物DUSP6的抑制作用也证实了这一现象。优立替尼对正常组织的影响并没有损害小鼠的健康，这可以通过对体重下降、行为等监测来评估。
优立替尼延缓了肿瘤的生长，并显著提高了BT40细胞的存活率。在BT40-PDX小鼠模型中，优立替尼可延缓肿瘤生长并显著提高小鼠的存活率，这可能是通过诱导细胞死亡实现的，体外研究也证明了这一点。在生存期方面，优立替尼的疗效优于化疗药物，这与另一项临床前研究一致，该研究显示优立替尼在BRAFV600E驱动的黑色素瘤A375PDX小鼠模型中的生存期显著优于替莫唑胺。总之，本研究表明优立替尼在BRAF驱动的pLGG中具有较高的临床价值，并将支持开展对pLGG的单药和联合疗法进行评价的I/II期研究。
有少数几种药物已被研究与优立替尼联合应用，如与帕博西利（palbociclib）联合治疗晚期胰腺癌和其他肿瘤（NCT03454035），或与羟氯喹联合治疗胃肠道腺癌（NCT04145297）。目前尚缺乏可靠的pLGG模型，现有模型不能完全体现pLGG的生物学特性，仅有BT40和DKFZ-BT66可用于建立大规模筛选药物的动物模型。既往研究发现BRAF抑制剂达拉非尼与优立替尼联用可协同抑制MAPK活性。在体外pLGG模型中I型或II型RAF抑制剂和ERK抑制（包括优立替尼和第二代I型BRAF抑制剂encorafenib）联合使用可协同抑制MAPK活性。另外，ERK和MEK抑制剂联合应用可广泛持久地抑制MAPK活性，特别是MEK抑制剂比美替尼在体外研究中协同作用最强，并在斑马鱼胚胎模型中与优立替尼联用显示出抗肿瘤潜力。有趣的是，在BRAFV600E突变模型中，司美替尼与优立替尼联用显示出协同作用，但在KIAA1549：BRAF融合模型中仅显示出加成效应。这表明司美替尼与优立替尼联用可能会对BRAF V600E突变的pLGG产生疗效，这在临床上很有意义，因为与KIAA1549：BRAF融合的肿瘤相比，司美替尼单药治疗BRAF V600E突变的pLGG的PFS更低。
本研究证明了在所有BRAF驱动的pLGG模型中优立替尼与BH3的模拟物有明显的协同作用。Navitoclax在体外始终显示出与优立替尼的协同作用，并在斑马鱼胚胎模型中显示出最高的PR率。Bcl-xL抑制剂A1331852在体外研究中显示出最强的协同作用。令人鼓舞的临床前数据支持使用BH3模拟物靶向诱导癌细胞衰老。因此，使用Bcl-xL抑制剂可能是一种很有前景的pLGG治疗方法。
总之，我们的数据证明了ERK抑制剂优立替尼治疗BRAF驱动的pLGG的临床疗效，并将支持在针对复发pLGG的I/II期研究中对其单药和联合用药的疗效进行首次评估。
参考文献：RomainSigaud et al. The first-in-class ERK inhibitor ulixertinib shows promising activity in mitogen-activated protein kinase (MAPK)-driven pediatric low-grade glioma models. Neuro-Oncology. 25(3), 566-579, 2023
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撰稿：孔晨晨
审校：张俊平
排版：张静静
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