口服给药途径提供了一个安全、快速和简便的给药过程，并且与肠外给药途径相比，结果是更大的患者舒适度和依从。由于稳定性，剂量一致性和与辅料共同配制的能力的优势，口服固体药物已经成为主要的配方: 它们一直占美国食品和药物管理局(FDA)批准的新药( https://www.FDA.gov/)的50% ，近70% 的美国人至少使用一种处方药。然而，某些患者群体与吞咽固体物质斗争。超过50% 的儿童不能吞咽标准大小的药丸或胶囊。吞咽困难或吞咽困难的患者同样需要坚实的药物。在成年人中，吞咽困难的患病率可高达16% ，37% 以上的人有吞咽困难。这可能导致患者跳过或修改(例如，粉碎)他们的药物，这可能导致药代动力学的改变和死亡。
虽然液体制剂更容易摄取，但它们容易在肠粘膜内被快速稀释，并且不能在空间上定位药物与赋形剂8，这对口服生物药物的努力构成了挑战。一个系统能够编程的液体到固体转变内的胃可以桥梁这两种形式的优势。固体基质可以促进药物和辅料的空间接近，调节药物释放或保护药物活性免受恶劣的胃环境，并增加药物仓库的胃停留。开发液体-固体系统的努力依赖于钙交联的可饮用水凝胶系统。口服碳酸钙负载的海藻酸盐溶液由于酸触发的 Ca2 + 离子释放和随后的海藻酸盐交联而在胃中发生凝胶化。类似地，结冷胶或海藻酸盐溶液与复合钙混合后经历原位胃凝胶化10。海藻酸钠/卡拉亚胶溶液的口服给药，然后是氯化钙溶液，结果在胃中形成胶状物11。还描述了一种包含海藻酸盐、碳酸氢钠和碳酸氢钙的抗酸药物。然而，这些单网络水凝胶在机械上很弱，可能无法承受胃内(高达13kPa)13的压缩力，导致配方的不可逆变形和潜在破坏。
在本文中，我们描述了一种新的策略，以使可饮用的液体原位形成和韧性(LIFT)水凝胶，其包括离子(钙/海藻酸盐)和共价(聚乙二醇)(PEG))聚合物网络以增强韧性14。LIFT 水凝胶在含有海藻酸钠和官能化 PEG 的聚合物溶液接触胃内的交联剂溶液后发生凝胶化(图1a，b)。我们广泛表征了在真实胃液中离体形成后的 LIFT 水凝胶以及在啮齿动物和大型猪模型中的体内形成，并证明它们原位形成固体的能力使得这些材料能够充当小分子控制释放的仓库。此外，以 CaCO3作为辅料的共包封保护口服递送的酶和治疗细菌的活性免受胃的低 pH 值的影响(图1c)。
Design and characterization of LIFT hydrogels
由于液体在胃中的停留时间相对较短(< 30分钟)和胃液的复杂性15,16，我们试图开发能够快速和强大地交联两个互穿聚合物网络的交联化学。海藻酸钠是一种研究得很好的生物相容性聚合物，来源于藻类，通常被认为是安全的(GRAS)状态，在钙的存在下经历了近乎瞬间的交联。由于已确定摄入的 PEgs17的安全性，我们将 PEG 用于第二个网络，并最初考虑了三种交联化学物质: N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯-胺、二苯环辛烷(DBCO)-叠氮化合物和马来酰亚胺-硫醇。由于在 NHS 酯胺反应期间未表征和潜在有毒的 NHS 离开组的进化以及商业上可获得的 DBCO- 和叠氮化合物功能化的 PEG 的缓慢动力学(> 1小时)(补充图1) ，我们继续开发通过马来酰亚胺-硫醇反应交联的 PEG 网络。这种化学的优点包括它的快速反应动力学，温和的反应条件和生物相容性18。为了确定一种安全的二硫醇交联剂，我们搜索了 FDA 批准的或含 GRAS 二硫醇的小分子，用于马来酰亚胺官能化的 PEG 的快速扩散和交联。二巯基丁二酸(DMSA)是由于其 FDA 认证状态和良好的人类安全性特征而被选中的19,20。还选择了以二硫醇为终止剂的线性聚乙二醇(分子量1,000 Da)进行评估。因此，我们的最终概念包括(1)摄入含有氯化钙和 DMSA 或 PEG-二硫醇的交联剂溶液，然后(2)摄入含有海藻酸盐和四臂 PEG-马来酰亚胺的聚合物溶液。当(3)在胃中混合时，聚合物溶液经过聚合物网络和凝胶的交联形成(4) LIFT 水凝胶(图1a，b)。
我们首先询问 LIFT 水凝胶是否能够在与摄入液体的胃滞留相关的短时间(20分钟)内形成。为了模拟体内形成条件，将含有0% ，5% 和10% w/v 四臂 PEG- 马来酰亚胺的0.5% w/v 海藻酸钠溶液滴加到交联剂溶液(200mM CaCl2/10mM PEG- 二硫醇或 DMSA)中，然后在37 °C 温育10-20分钟。产生的水凝胶是机械拥有属性压缩试验。与海藻酸盐水凝胶相比，LIFT 水凝胶承受了更大的载荷(图2a，b 和补充图2a)。经过90% 的应变，LIFT 水凝胶大部分保持球形，而海藻酸盐水凝胶保持永久变形(图2c 和补充图2b)。LIFT 水凝胶进一步进行了机械拥有属性的循环压缩试验。虽然 LIFT 水凝胶可以维持至少5个周期的90% 菌株，海藻酸盐水凝胶在一个周期后仍然永久变形，并且不能维持后续菌株(补充图3)。由于5% w/v 含 PEG 的 LIFT 水凝胶比10% w/v 含 PEG 的 LIFT 水凝胶具有更好的力学性能和更容易操作，因此对该组合物进行了进一步的表征。这种现象可能是由于5% w/v PEG 与海藻酸钠的溶解和混合较大所致。为了测试 LIFT 水凝胶在体内的形成能力，在新鲜猪胃液中以不同稀释度在水中形成水凝胶。作为对照，将水凝胶与 LIFT 或无胃液形成的海藻酸盐水凝胶进行比较。虽然胃液减弱了 LIFT 水凝胶的机械性能，但这些水凝胶比在理想条件下形成的海藻酸盐水凝胶在机械上更坚韧(图2d 和补充图2c)。LIFT 水凝胶成分也在多种细胞系中进行了细胞毒性试验。在相关浓度下连续孵育24小时后，没有观察到细胞毒性的主要原因(补充图4)。总的来说，这些数据表明即使在胃液中也可以快速形成 LIFT 水凝胶，所得到的水凝胶具有机械韧性，DMSA 和 PEG- 二硫醇交联剂都能够交联共价 PEG 网络，并且水凝胶组分具有生物相容性。
采用流变学方法进一步研究了 LIFT 水凝胶的形成动力学。为了模拟快速海藻酸盐交联并促进实验，首先将水凝胶与 CaCO3和葡萄糖 -δ- 内酯内部交联，然后在200mM CaCl2/10mM PEG- 二硫醇溶液中进行分析。值得注意的是，模量的最大增加发生在前10-15分钟(图2e) ，进一步支持了在与胃内液体滞留相关的时间范围内进行胃交联的可行性(排空50% 的时间: 15-30分钟)15,21。然后使用155kDa 葡聚糖作为模型大分子和20或100nm 聚苯乙烯纳米颗粒作为模型控释纳米颗粒，研究 LIFT 水凝胶包封不同长度尺度的治疗货物的能力。将包裹这些模型货物的 LIFT 或海藻酸盐水凝胶浸入在不同时间点取样的模拟胃液(SGF，pH1.77)或模拟肠液(SIF，pH6.8)中。两种水凝胶都不能在任何一种培养基中保留葡聚糖(> 75% 的释放) ; 然而，与海藻酸盐水凝胶相比，LIFT 水凝胶在 SIF 中表现出较少的纳米颗粒释放(< 1-6%)24小时后(70-77% ，图2f)。这与之前报道的碱性环境中海藻酸盐水凝胶孔径增大和释放的情况一致22,23。因此，由于 LIFT 水凝胶在不同的 pH 范围和/或较小的孔径下具有更大的稳定性，因此可能能够在不同的长度尺度上保留治疗性货物。
Characterization of LIFT hydrogels in large animals
然后对 LIFT 水凝胶在体内的形成、动力学和安全性进行测试。使用猪模型是因为它们的肠粘膜大小与人类相似。首先，交联剂(200mM CaCl2/10mM DMSA 或 PEG- 二硫醇)和聚合物溶液(0.5% 海藻酸盐/5% w/v 四臂 PEG- 马来酰亚胺)的施用顺序变化。通过内窥镜将溶液注入猪的胃内，5-8小时后观察水凝胶结构。无论给药顺序如何，在胃腔内形成水凝胶。首先施用交联剂，然后施用聚合物溶液，导致胃内面条状水凝胶的可重复形成; 相反的顺序导致较大但不一致的大块水凝胶(图3a 和补充图5)。因此，LIFT 水凝胶在体内形成的交联剂首先施用，然后聚合物溶液。然后通过含20% w/v 硫酸钡的水凝胶的 X 射线成像研究了 LIFT 水凝胶在体内的传输时间。一般而言，LIFT 水凝胶在给药后24小时仍保留在胃内(图3b 和补充图6) ; 相比之下，在禁食和进食状态下，液体在0.4 -1.4小时内从猪胃中排出24。在给药后48小时内没有观察到肝脏或肾脏功能的变化(补充表1)。这些数据支持 LIFT 水凝胶及其组分被安全地清除，不会引起阻塞，也不会引起毒性。在胃腔形成后，通过循环压缩试验对 LIFT 水凝胶的力学性能进行了表征。LIFT 水凝胶更坚韧，能够维持至少5个90% 的循环菌株，而海藻酸盐水凝胶在一个循环后仍然保持平坦(图3c-e 和补充图7)。
LIFT hydrogels modulate small molecule release
在确定 LIFT 水凝胶可以在体内形成之后，我们评估了它们包裹和调节小分子释放的能力。我们选择本芴醇作为模型小分子药物，因为它在水中的溶解度较差，因此，将形成一个药物悬浮液，形成后被包裹在水凝胶中。使用200mM CaCl2/10mM DMSA 作为交联剂溶液将水凝胶施用于猪的胃中; 本芴醇悬浮于0.5% 海藻酸盐/5% w/v 四臂 PEG- 马来酰亚胺 LIFT 聚合物溶液中。以明胶丸装载的本芴醇粉末为对照，给予960mg 本芴醇。而游离本芴醇在给药后5-7小时导致血浆浓度峰值，水凝胶(海藻酸盐和 LIFT)制剂导致血浆药物浓度在 something 24小时达到峰值(图4a)。游离药物，海藻酸钠和 LIFT 水凝胶释放药物的曲线下面积(AUC)分别为14,873.5 ± 2,719.2,7.568.4 ± 3,780.6和10,337.5 ± 3,849.7 ng h-1ml-1，无统计学差异(图4b)。尽管药物 AUC 没有差异，但游离药物(901.2 ± 197.1 ng ml-1)的最大观察药物浓度(Cmax)显着高于海藻酸钠(283.8 ± 147.3 ng ml-1)和 LIFT (338.7.122.6 ng ml-1)水凝胶(图4c)。这些数据共同支持 LIFT 水凝胶在较低血浆浓度下作为游离药物提供可比总剂量的药物的能力，这可能降低药物毒性。
LIFT hydrogels protect therapeutic enzyme activity
我们接下来评估了 LIFT 水凝胶口服递送酶的能力，这是具有挑战性的，因为酸性胃液和蛋白酶存在于胃肠道26。选择 β-半乳糖苷酶(乳糖酶)是因为需要延长胃中的乳糖酶活性以减轻乳糖不耐受症状27。事实上，与磷酸盐缓冲盐水相比，在 SGF 中孵育时乳糖酶活性显著降低(PBS; 图5a)。然后将乳糖酶包裹在海藻酸钠或 LIFT 水凝胶中以及作为中和酸性胃液的辅料的碳酸钙中。选择 CaCO3是因为它不溶于水，因此可以滞留在水凝胶中，并且因为它的 GRAS 状态。由于 DMSA 交联剂减弱了乳糖酶活性(补充图9) ，这些 LIFT 水凝胶利用了 PEG- 二硫醇交联剂。当用 SGF 攻击时，含有 CaCO3的水凝胶保持乳糖酶活性(图5b) ，强调了 LIFT 水凝胶与酶的相容性。除了胃液呈酸性外，肠粘膜中还含有大量能够降解酶的蛋白酶。我们询问水凝胶是否能够作为模型蛋白酶保护胰蛋白酶。与游离乳糖酶或包裹在海藻酸盐水凝胶中的乳糖酶相比，LIFT 水凝胶对乳糖酶活性的保护作用最大(图5c)。因此，与海藻酸盐水凝胶相比，LIFT 水凝胶除了共包封 CaCO3之外，由于密度更大的双重聚合物网络，可能对蛋白酶表现出额外的屏障。
然后测试 LIFT 水凝胶在体内保护乳糖酶活性的能力。与在猪身上进行的研究类似，首先通过口服灌胃给予大鼠交联剂溶液，然后立即给予含有含有或不含有 CaCO3的乳糖酶的聚合物溶液; 作为另外的对照，将 CaCO3悬浮于交联剂溶液中。每只动物的 CaCO3剂量小于制造商确定的每天7-10g 的最大日剂量(假设人为75kg)28。因此，这组处理测试了单独施用(LIFT + CaCO3)或共包封(LIFT/CaCO3)的 CaCO3的效果。口服管饲导致大鼠胃中强烈的水凝胶形成(补充图10) ，并且在胃中体内孵育后回收水凝胶并测定乳糖酶活性。值得注意的是，虽然分离和共包封的碳酸钙显着保护乳糖酶活性后1小时(图5d) ，只有共包封的碳酸钙保护乳糖酶后2小时(图5e)。在体内孵育6小时后，在猪模型中也观察到共包封 CaCO3的 LIFT 水凝胶的保护作用(图5f) ，强调了能够在大型动物模型中共包封赋形剂的口服系统的优势。我们进一步验证了 LIFT 在大鼠体内和体外与其他酶更广泛的相容性(补充图11和补充讨论)。
LIFT hydrogels protect therapeutic bacteria viability
吞咽困难和吞咽困难是口服药物给药的主要障碍。在这里，我们开发了一种饮用配方，称为 LIFT 水凝胶，能够从液体过渡到固体混合在胃里。LIFT 水凝胶具有固体制剂的优点，包括增强的胃滞留，对胃肠道蛋白酶的保护，机械韧性，控制药物释放的能力，以及用辅料共包封敏感治疗剂。为了实现 LIFT 水凝胶，我们使用 FDA 批准的或 GRAS 材料: 海藻酸盐和四臂聚乙二醇-马来酰亚胺作为水凝胶网络，氯化钙和 DMSA 或聚乙二醇作为交联剂。在与胃内的交联剂接触之前，聚合物溶液保持为液体，触发从液体到坚韧的水凝胶的转变。
胃环境表现出一些适合于原位交联的特征。胃的温度控制在37 °C，这可以加速马来酰亚胺-硫醇硫醚的形成40; 胃也具有机械活性，这可以促进摄入溶液的混合13。我们证明这两种聚合物网络的交联容易发生在离体猪胃液和体内猪和大鼠胃，这强调了交联化学的稳健性。虽然马来酰亚胺与硫醇的反应很快，但海藻酸钠的包合增强了 LIFT 水凝胶的力学性能。此外，它在钙中的直接交联作为一种“支架”，促进缓慢形成的硫醚键的保留和交联。高度定义的马来酰亚胺: 硫醇比率通常是有效交联所必需的，这在口服环境中是具有挑战性的[18,40] ; 在这里，海藻酸盐内的支架可能使二硫醇逐渐扩散到水凝胶中并交联 PEG 网络。虽然 LIFT 水凝胶的形成和力学性能取决于胃液体积的比例，这可能是通过更大体积的交联剂稀释。禁食的胃含有25-35ml 胃液21,41，在摄入200ml 交联剂溶液后将其稀释至11-15% 。这个体积小于一个典型的饮料罐(355毫升)的体积，这个比例的胃液是完全在范围内的交联 LIFT 的能力。值得注意的是，这些反应不产生副产物，并且在给药后48小时内，水凝胶似乎对培养的细胞没有毒性，也不会引起猪的临床(例如便秘和食欲不振)或血液化学信号。一个重要的优势，LIFT 赋予超过颗粒悬浮液是原位凝胶的宏观结构，这是重要的，以尽量减少剂型暴露于胃液。在材料体积相同的情况下，纳米剂型和微米剂型比宏观剂型的表面积体积比更大。Economou 等人发现，CaCO3颗粒的溶解速率与粒径有关，较大的2-4mm 颗粒在酸中的溶解速度比 < 250μm 颗粒慢42。因此，宏观结构的原位凝胶化能够通过尺寸和几何形状来保护包封的治疗剂。此外，与颗粒悬浮液相比，大尺度固体的形成可以延长包囊药物的胃滞留。我们发现 LIFT 水凝胶通过延迟和降低最大药物血浆浓度来改变药代动力学，同时达到与游离药物相当的药物 AUC。这是重要的，因为高药物浓度可能导致不良副作用和影响治疗耐受性 ，并且适用于由 AUC 而不是血液浓度(例如四环素)驱动功效的药物。LIFT 还可以控制水溶性药物的释放，这需要颗粒包封或共价附着在 LIFT 聚合物上以防止爆裂释放。LIFT 中的制剂赋予了更长的转运时间和减少的表面积体积比的额外优势，可以进一步控制释放; 此外，包含蛋白酶或 pH 敏感的接头可以使特定组织内的程序性释放成为可能。由于一系列分子在血液和胃肠道之间处于平衡状态 ，调节胃内这些分子的口服疗法可以非侵入性地治疗疾病。例如，工程菌可以感知和代谢特定的分子，并且正在开发用于治疗高草酸尿症和苯丙酮尿症的酶疗法。将 LIFT 水凝胶与这些治疗剂偶联可以延长它们在坚韧形状因子中的停留时间和活性。我们设想 LIFT 可以通过共封装调节局部环境和治疗本身的辅料(例如，CaCO3)作为一个顺应的“生态位”。当 LIFT 水凝胶通过肠粘膜时，水凝胶的孔隙有助于接触宿主代谢物和分泌治疗因子。
原文：https://www.nature.com/articles/s41563-024-01811-5
来源：先进材料
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