第一法 金黄色葡萄球菌定性检验
01 操作步骤
1) 样品的处理 : 称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~ 2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。
2) 增菌 : 将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18h~24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊 生长。
3) 分离 : 将增菌后的培养物，分别划线接种到 Baird-Parker平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培养18h~ 24h。Baird-Parker平板36 ℃±1 ℃培养24h~48h。
4) 初步鉴定 : 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm~3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色(非白色)的边缘，周围绕以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。
在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色)，菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
5) 确证鉴定：
① 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为 0.5μm~15μm。
② 血浆凝固酶试验：挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选)，分别接 种到5mL BHI和营养琼脂小斜面，36 ℃±1 ℃培养18h~24h。
取新鲜配制兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入 BHI培养物0.2 mL~0.3 mL，振荡摇匀，置 36 ℃±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌 菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36 ℃±1 ℃培养18h~48h，重复试验。
02 结果报告
结果判定：符合4、5，可判定为金黄色葡萄球菌。
结果报告：在25g(mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。
03 注意要点
1) 7.5%氯化钠肉汤增菌培养：
① 若样品本身在均质后清澈，培养18h观察呈现一定程度的浑浊（与培养前相比），则接种平板；若18h后仍无变化，继续培养至24h后无论浑浊与否都接种至平板；
② 若样品本身在均质后浑浊，则直接培养至24h后再接种平板。
2) 血平板：36±1℃培养18h后观察，若有菌落生长或有菌落生长的迹象（无论是否溶血），则应酌情配制NA、BHI并分装至小试管中（NA 10mL/管、BHI 5mL/管）、灭菌后NA应斜放凝固成琼脂斜面备用。至血平板培养至24h取出，挑取菌落进行革兰氏染色镜检，同时挑取菌落接种至NA斜面、BHI肉汤管，36±1℃培养24h。
3) 接种原则：
① 革兰氏染色后还剩余10个或10个以上菌落，则NA、BHI分别接种5管；
② 若多于5个（不包括5个）不足10个，则BHI接种5管，剩余的接种NA；
③ 5个及以下则全部接种BHI，不接种NA。
4) BP平板：36±1℃培养24h后观察，有菌落生长则取出，无菌落生长则继续培养至48h后再观察。若血平板已挑取菌落进行证实试验，则不必再挑取BP平板上的菌落进行实验。若血平板上无菌落生长，则应在24h～48h内逐步观察BP平板是否长菌或有无长菌迹象，有则需配置BHI及NA，挑取BP上的菌落进行纯化、增菌，36±1℃培养24h。
5) 血浆凝固酶试验：
① 根据BHI管数，取冻干血浆粉，每瓶用移液枪加入0.5mL生理盐水，使其充分溶解，再换移液枪枪头取0.3mLBHI培养物加入其中（每管BHI用1个枪头），振荡摇匀后于36±1℃培养，计时，每30min观察一次，如呈现凝固（将试管倾斜或倒置时出现凝块）或半凝固（一般的液体呈现凝固）则判定为阳性。若一直不凝固，则一直观察，直至观察至6h（查看12次）还未凝固，则试验终止，判定为阴性结果；若中途出现完全凝固或半凝固，则试验终止，判定为阳性结果。
② 同时取金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 6538以及CMCC（B）26003各一支）制成菌悬液后作为阳性对照、以灭菌生理盐水为阴性对照，分别接种至BHI中同步培养后进行血浆凝固酶试验。
③ 若血浆凝固酶试验结果可疑，则挑取NA上的菌落接种BHI再次进行试验。
第二法 金黄色葡萄球菌平板计数法
01 操作步骤
1) 样品的稀释
① 固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯 内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，或置于盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min，制成1∶10的样品匀液。
② 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形 瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。
③ 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。
④ 按3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或 吸头。
2) 样品的接种：根据对样品污染状况的估计，选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进 行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别 加入三块 Baird-Parker平板，然后用无菌涂布棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如 Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 ℃~50 ℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
3) 培养：在通常情况下，涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36 ℃±1 ℃培 养1h；等样品匀液吸收后翻转平板，倒置后于36 ℃±1 ℃培养24h~48h。
4) 典型菌落计数和确认：
① 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为 2 mm~ 3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色(非白色)的边缘，周围绕以不透明圈(沉淀)，其外常有一 清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈 和清晰带外，其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。
② 选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU~ 200CFU 之间的平板，计数典型菌落数。
③ 从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验。分别做染色镜检，血浆凝固酶试验；同时划线接种到血平板36℃±1℃培养18h~24h后观察菌落形态，金黄色葡萄球菌菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色)，菌落周围可见完全透明溶血圈。
02 结果计数
1) 若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU~200CFU 之间，计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算。
2) 若最低稀释度平板的典型菌落数小于20CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算。
3) 若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算。
4) 若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU，而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在20CFU~200CFU 范围内，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算。
5) 若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20CFU~200CFU 之间，按式(2)计算。
计算公式：
03 结果报告
根据上面的公式计算结果，报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌数，以 CFU/g(mL)表示；如T 值为 0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
04 注意要点
1) 取1mL样品稀释匀液接种3个BP平板（此处并未严格按照标准中0.3mL、0.3mL、0.4mL精确取样，由于如此操作会增加试验时间，无法在15min内完成试验）。
2) 涂布时不要触及平板边缘（会导致样液涂抹不均匀，大部分汇集于边缘）。
3) 可用同一根涂布棒从低稀释度到高稀释度进行涂布（不用换涂布棒）。
4) 涂布完成后应稍微放置一段时间使培养基吸收样品匀液。
5) 若水珠较多，可正置于培养箱中1～2h后再倒置培养。
6) 36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。
第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数法
01 操作步骤
同第二法。
02 接种培养
1) 根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进行 10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别接种 1 mL 样品匀液至 7.5% 氯化钠肉汤管(如接种量超过 1mL，则用双料7.5%氯化钠肉汤)，每个稀释度接种3管，将上述接种物36℃±1℃培养，18h~24h。
2) 用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环，移种于Baird-Parker平板36℃ ±1 ℃培养，24h~48h。
03 典型菌落确认
同第二法。
04 结果报告
根据证实为金黄色葡萄球菌阳性的试管管数，查MPN检索表，报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数，以 MPN/g(mL)表示。
05 注意要点
1) 样品稀释同菌落总数，取3个连续稀释度稀释液（或包括液体样品原液），每个稀释度接种3管7.5%氯化钠肉汤，每管接种1mL，36±1℃培养18h后观察，若出现浑浊则接种至BP平板，若无变化则继续培养至24h后再接种至BP平板。
2) 划线接种至BP平板，36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。
3) 根据证实后的阳性管数差MPN表得出结果。
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