<<——【·前言·】——>>
在美国俄亥俄州中部的SciotoRiver中，特别是那些接收废水流的地方，可以传播抗菌药物耐药细菌、抗菌药物抗性基因和抗生素。
我们评估了鱼类是否可以作为ARB和抗菌药物污染的潜在指示物，并研究了抗菌药物暴露对鱼类肠道抗药基因组的影响。
我们从两个为哥伦布大都会地区提供服务的废水处理厂输入的河段中收集了77条鱼。通过培养方法、微滴数字PCR和超高性能液相色谱串联质谱对鱼类进行了筛查。
检测头孢菌素耐药和碳青霉烯耐药细菌、流行性碳青霉烯酶基因以及抗生素药物和代谢物的存在。
近21%的鱼类携带了CeRO，其中19.4%的鱼类表现出由blaCMY编码的AmpC基因型的细菌，7.7%的鱼类表现出由blaCTX-M编码的广谱β-内酰胺酶表型。
blaKPC和blaNDM分别存在87.7%和80.4%的肠道样本中，平均丰度为104个拷贝。在肝脏样本中发现三种抗生素-林可霉素、阿奇霉素和磺胺甲噁唑，平均浓度在25-31ng/g之间。
携带blaCTX-M的鱼类和暴露于阿奇霉素的鱼类可能位于废水处理厂的下游，将抗生素富集在肝脏中的鱼类并没有更有可能携带CeRO、CRO或流行性碳青霉烯酶基因拷贝。
研究结果证实，鱼类可以成为受到ARB、ARG和抗生素污染的地表水的有效生物指示物。我们的研究结果突出了在水生生态系统中促使ARB建立的不同机制的重要性的差异。
一、ARB的建立和持续存在的动态因素
抗生素耐药细菌，通常被称为“超级细菌”，经常在经过处理的废水排放物中排放到邻近的河流和其他地表水中。
特别是那些接收医院和其他卫生设施废水输入的河流和其他水生生态系统，是ARB、抗菌药物抗性基因以及抗菌药物及其代谢物的传输库。
尽管经过处理，废水排放物仍然是抗药细菌和抗菌药物残留物的来源，通常被排放到地表水中。
抗生素耐药细菌和抗生素耐药基因在抗菌药物使用地点之外的环境中传播，对公共卫生、兽医学和环境健康构成严重威胁。
已知陆地野生动物携带ARB，可以促使ARB传播到其他环境组分和宿主。水生动物，如水獭和河马，也可以是ARB的宿主，水生植被和河流沉积物被认为是可能的来源。
对于鱼类，大量研究已经将ARB与养殖鱼类联系起来。然而，很少有研究探讨野生鱼类是否可以作为ARB的潜在生物指示物。
此外，尚未确定ARB在环境中的出现途径的相对贡献，无论是通过引入和建立ARB和/或ARG，还是通过抗菌药物或其代谢物的治疗和亚治疗浓度直接选择耐药亚种群。
由于河流和其他地表水体的多种用途性质，更深入地了解潜在的ARB哨兵和建立和维持ARB的动态将对制定策略以最小化ARB传播到广泛的其他环境和宿主。
包括人类，至关重要，在这里，我们利用来自美国中西部一个接收来自主要大都会区的处理过的废水流的河流中的鱼类。
以确定ARB和抗菌药物污染的存在，并了解抗菌药物暴露对鱼类肠道抗药基因组的影响。
共收集了77条鱼，代表了22个不同的物种，包括栖息在底栖和水体中的食物来源的鱼类携带由blaCMY和blaCTX-M基因分别编码的AmpC样和/或ESBL表型。
七株细菌分泌了碳青霉烯酶，然而这些细菌代表了非流行的菌株，具有物种特异性的染色体编码碳青霉烯酶。
在77条鱼的样本中，65条和46条具有足够的肠内容物以进行blaKPC和blaNDM的ddPCR检测。
57个样本携带blaKPC基因，37个样本携带blaNDM基因在它们的肠抗药基因组中。综合考虑，65条鱼中的100%都具有blaKPC或blaNDM基因，或者两者兼有。
blaKPC和blaNDM的基因丰度平均为每克肠内容物104个拷贝，ARB和ARG与生态因素。
如位于废水处理厂下游或觅食状态等，没有关联，尽管blaCTX-M更频繁地在下游捕获的鱼中被鉴定出。
我们确定了三种代表不同药物类别的抗生素，在鱼类的肝组织中生物富集。通过这些化合物在肝脏中的生物富集，可见抗菌药物曝露存在于37条经过检测的鱼中。
林可霉素曝露存在于15条的鱼肝中，平均浓度为30.26ngg-1。阿奇霉素存在于24条的鱼肝中，平均浓度为30.6ngg-1。磺胺甲噁唑存在于三条的鱼肝中，平均浓度为25.6ngg-1。
生态因素并未影响抗生素曝露，但废水处理厂下游的鱼类更有可能暴露于阿奇霉素。一些鱼类中的ARB和抗生素浓度与废水处理厂下游的位置相关联。
这表明WWTP的输入可能会改变环境污染。之前的研究支持了这一结论，因为WWTP的排放物可能携带ARB、ARG和抗生素，而这些输入通常在WWTP排放点下游更为普遍。
然而，在这项研究中，一些抗生素浓度和ARB在WWTP输入的下游并没有以更高的数量或频率被检测到。
这可能反映了鱼类在河流中的移动对于在生态系统的微环境中传播ARB和ARG的重要性。
肝提取物中发现的三种抗菌药物与肠道抗菌药物耐药基因组中ARB和ARG的存在之间没有关联。肝脏中存在阿奇霉素增加了在鱼类肠道样本中携带blaCTX-M细菌的可能性。
然而，在控制了位于WWTP下游的鱼类后，调整后的比值比为2.92，与肠道中携带blaCTX-M细菌的存在没有显著关联。
肠道抗菌药物耐药基因组与三种抗生素暴露之间的缺乏关联表明，接触这些抗菌药物不会显著促使β-内酰胺耐药细菌和基因在环境中建立和传播。
虽然β-内酰胺药物是最常被开处方的抗生素之一，但它们是本质上不稳定的化合物，受到多种生物和非生物因素的降解。
关于β-内酰胺药物在地表水中的报告并不常见，如果存在的话，它们通常以微量存在。然而，ARB和ARG在废水排放物和地表水中经常被报道。
在先前研究的背景下，表明环境地表水与β-内酰胺耐药细菌和基因的污染可能在建立环境和野生动植物库方面发挥更大的作用。相对于本研究中测试的抗生素的曝露/选择性压力。
二、鱼类对抗菌素耐药性的反应
2017年和2018年期间，我们从俄亥俄州哥伦布的SciotoRiver流域采样了鱼类。这个流域接收来自为哥伦布和周边郊区提供服务的两个废水处理厂的废水流。
这些废水处理厂接收各种废水，包括来自医院的废水，平均每天处理712百万升的废水。我们在流域的24个地点使用船只和背包电鱼器采集了鱼类，遵循Dorobek等人的方法。
鱼类被鉴定到物种水平，并在冰上运送到实验室，使用无菌工具收集了肝脏和肠道内容物。
采样地点的访问和鱼类的采集是通过俄亥俄州野生动物部门授予的，野生动物许可证-科学收集21-134。
鱼类和其组织的捕获、安乐死和采样经过了俄亥俄州立大学动物护理和使用委员会的审查和批准。
安乐死是通过将鱼浸泡在含有缓冲的MS-222的水溶液中或颈部脱位后接着使用刺针完成的。肝内容物存放在琥珀色瓶中，存放温度为零下80°C。
将一份肠内容物拭子接种到含有2μg/mL头孢噻肟的改良MacConkey培养基中，培养24小时。
然后，从培养基中接种一份到三个MacConkey平板上，一个含有8μg/mL头孢噻肟，一个含有4μg/mL头孢吡肟，还有一个含有0.5μg/mL美罗培南和70μg/mL硫酸锌七水合物。
用于分离表达AmpC、广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯耐药表型的细菌。从这些平板上挑选出一份能够发酵乳糖、产生吲哚的AmpC样和ESBL细菌菌落。
然后使用先前报道的PCR方案和引物检测blaCMY和blaCTX-M的存在。对于具有不同菌落形态的高达三种碳青霉烯耐药菌株。
使用CarbaNP试验进行碳青霉烯酶产生测试，并通过MALDI-TOF进行物种鉴定。
其余的肠内容物通过微滴数字PCR检测流行性碳青霉烯酶基因blaKPC和blaNDM的存在，以定量估算每克肠内容物中的基因拷贝数，方法与先前描述的相同。
冷冻的肝脏样本被均质化，提取过程与先前描述的方法相同。
取100μL的提取物样本，用水稀释至1mL，并使用AgilentUHPLC1290耦合Agilent6545QTOF-ESI-MS在正离子和负离子模式下进行分析。
由于某些鱼类的肝组织不是很丰富，因此只能进行一次重复实验。在肝脏重量小于0.5克的样本中，使用整个样品。
样品提取物使用12种靶向抗生素化合物进行抗菌药物残留测试。此外，使用AgilentMassHunterProfinder软件B.010.0对样品提取物进行了疑似抗菌药物靶标的筛查。
并将profinder归档文件导入到MassProfilerProfessional中，在Agilent兽药PCDL和水质筛查PCDL库中进行搜索。
该方法已根据回收率、精密度和基质效应进行了评估，采用不同的方法，例如质量控制样本，用于评估数据的质量。
我们采用了逻辑回归模型来表征ARB和ARG的存在与抗生素化合物曝露、采集地点以及觅食群体之间的潜在关联，这是基于物种鉴定的。
类似的模型被用来表征抗生素化合物曝露与采集地点和觅食群体之间的关联。在无法计算出比值比的模型中，我们使用Fisher's精确检验来检测统计学关联。
所有的统计分析和数据可视化均使用STATAv.15.1和GraphPadPrismv.9.0.0进行。
三、总结
我们的研究结果支持鱼类暴露于污染地表水的ARB、ARG和抗生素，并且它们很可能是地表水中ARB的可靠生物指示物。
鉴于鱼类普遍存在、代表多个营养级别、通过它们的觅食栖息地整合了非生物环境，并长期以来一直被用作水生生态系统状况的指标。
需要进一步的研究来探讨饮食和生活史策略如何影响鱼类中ARB的传播，以及目标分类或功能性群体是否最有效地作为ARB污染的哨兵。
鱼类还很可能在地表水生态系统内传播这些污染物方面发挥重要作用，以及通过水陆食物链联系将其传播到陆地环境中。
地表水的污染构成了潜在的“一体健康”风险，因为地表水用于许多对人类、动物和环境健康重要的活动。
热门跟贴