中药2区-江中: 代谢组结合网药分析揭示葛根通过精氨酸代谢途径改善肺纤维化|精氨酸|肺纤维化|脯氨酸|蛋白

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导读

葛根是典型的药用和食用植物，在中国和东南亚有着悠久的应用历史。作为一种应用广泛的传统药物，葛根具有抗炎、解热、抗氧化、止咳、平喘等特点。特别是，越来越多的证据表明，葛根在代谢调节方面对纤维化相关疾病具有治疗作用。然而，葛根对肺纤维化（PF）的作用机制尚未被深入探讨。本研究旨在结合代谢组学和网络药理学分析，探讨葛根的精氨酸代谢产物对PF模型的影响，这可为寻找葛根抗肺纤维化的靶点提供新的思路。结果表明，葛根改善了PF大鼠的肺功能，并缓解了病理症状，如病理损伤、胶原沉积和体重减轻。另外，通过采用血浆代谢组学方法筛选氨基酸、脂质、类黄酮、花生四烯酸代谢产物、糖苷等差异代谢产物，本研究发现精氨酸代谢信号传导主要参与了葛根对PF大鼠的调节。此外，网络药理学预测精氨酸代谢途径具有较高的优先性。进一步整合代谢组学和网络药理学，分子对接将NOS2、MMP9和TNF-α鉴定为葛根调控的关键基因。重要的是，葛根素和NOS2之间有很强的亲和力。葛根降低PF大鼠的TNF-α、MMP-9和NOS2水平，抑制TNF-α和MMP-9蛋白表达，并降低L-OT和NOS2含量。这些结果表明，葛根的作用可能通过精氨酸代谢途径改善大鼠PF。因此，葛根可能是一种潜在的PF治疗药物。

论文ID

原名：Integrating metabolomics and network pharmacology analysis to explore mechanism of Pueraria lobata against pulmonary fibrosis: Involvement of arginine metabolism pathway

译名：结合代谢组学和网络药理学分析探讨葛根抗肺纤维化的机制:精氨酸代谢途径的参与

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：5.4

发表时间：2024.05

通讯作者：屈飞&崔艳茹

通讯作者单位：江西中医药大学

实验设计

实验结果

1. 葛根减轻博来霉素（BLM）诱导的大鼠PF病理症状

肺纤维化的动物模型通常由博来霉素诱导，这往往是由病理症状的异常变化引起的，与肺纤维化患者的特点相似。在本研究中，与PF组相比，葛根增加了BLM诱导的PF大鼠体重（P<0.01）（图1A）。此外，还检测了肺功能指标，我们观察到PF组的Cdyn、EF50和PEF降低，葛根逆转了Cdyn、EFI0和PEF的降低（P<0.05）（图1B–D）。我们还证实了葛根对肺组织的病理损伤有改善作用。HE染色结果显示PF大鼠肺组织结构部分破坏，肺泡失代偿，masson染色结果显示胶原纤维增加，纤维组织增生。葛根显著保护了PF大鼠的肺泡组织结构，并减轻了炎症细胞的浸润（图1E）。重要的是，在PF大鼠中，葛根减少了胶原纤维在肺组织中的沉积（图1F）。总之，数据初步验证了葛根改善PF大鼠的病理症状。

图1 葛根对PF大鼠的药效学作用。（A）实验期间大鼠的体重变化。（B）所有实验组的PEF比较（n=6）。（C）所有实验组的EF50比较（n=6）。（D）所有实验组的Cdyn比较（n=6）。（E）HE染色（比例尺=50μm）观察大鼠肺组织学变化。（F）用Masson染色法观察葛根对大鼠胶原沉积的影响（比例尺=50μm）。组织损伤用红色箭头标记。与CON组相比，##代表p<0.01。与PF组相比，**表示p<0.01。CON组：对照组，PF组：模型组，YG-M：葛根3.2g/kg组，YG-H:葛根6.4g/kg组。

2. 血浆代谢组学的多因素分析及稳定性研究

代谢组学用于鉴定生理和病理过程之间的关系，并揭示动物模型中代谢产物的差异表达。在这项工作中，无监督PCA评分图显示，血浆QC样本在正离子和负离子模式下聚集良好，这表明仪器方法是稳定的。因此，对照组和PF模型组的样本实现了更好的分离，我们发现每组内的单个样本没有重叠，这意味着PF模型组与对照组有显著差异（图2A）。此外，在区分能力更强的正负离子模式下使用监督OPLS-DA，所有组的血浆样品都实现了更好的聚集，PF模型组与对照组完全分离，总体差异显著（图2B）。在OPLS-DA模式S图中，右上角和左下角的代谢物差异更显著（图2C–E）。这一发现表明，原始模型的预测能力大于任何随机阶y变量的预测能力。换言之，该模型是有效的，并且可以进行分析。

图2 PF模型组、对照组和给药组的PCA、OPLS-DA和PLS-DA分析。（A）PF模型组和对照组的PCA评分图。（B）PF模型组和对照组的OPLS-DA评分图。（C）置换检验图。（D）S图。（E）不同药物组血浆样本PLS-DA评分图。

3. 葛根治疗PF的潜在生物标志物和途径的整合分析

我们总共筛选出20种差异代谢产物（表2）。与对照组相比，PF模型大鼠的11种血浆生物标志物上调，9种血浆生物标志物下调。此外，基于先前的结果，血浆代谢组学鉴定了12种与葛根调节PF相关的血浆生物标志物（图3A和B）。最后，我们使用MetaboAnalyst和KEGG的代谢分析工具来分析潜在生物标志物的富集途径。葛根干预后，富集了六种主要代谢途径，包括精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、氮代谢、外源物质的细胞色素P450代谢、花生四烯酸代谢和色氨酸代谢（图3C）。

表2 LC-MS鉴定的差异代谢物

4. 葛根活性成分靶向肺纤维化关系分析

网络药理学以大鼠血浆代谢组学为基础，反映了中药多组分、多靶点、复杂疾病相互作用的特点。根据TCMSP和Swiss adme系统的标准，我们从葛根中共获得16种化学成分，使用OMIM、Disgenet和Drugbank数据库搜索“肺纤维化”作为关键词，共筛选了6249个靶点。在Venny2.1在线软件绘图工具平台上绘制Venn图，以获得药物疾病共同靶点（图4A）。为了进一步探索葛根对PF影响的潜在机制，我们构建了一个PPI网络来研究靶点之间的相互作用，这些相互作用是根据靶点在网络中的程度来确定的。有240个共同靶点被上传到String平台，选择的物种是“智人”，置信度大于0.9表示高置信度。PPI网络分析表明，葛根可能通过调节多个靶点对PF产生抑制作用。总共有20个靶点具有高度相互作用，包括NOS2、TNF-α、MMP-9、TP53、STAT3、NOS3、FOS等。NOS2的degree值远高于其他靶点，它作为精氨酸代谢途径发挥着关键作用，参与调节PF中的氧化应激、炎症和胶原沉积（图4B和C）。

图3 差异代谢产物的相关性分析结果与代谢途径分析图。（A）各组血浆中差异代谢产物相对丰度比较柱状图。（B）葛根的差异代谢产物热图。（红色，上调；蓝色，下调）。（C）代谢途径分析图。圆圈颜色表示P值，P值越小，颜色越深，圆圈区域表示路径影响，区域越大，影响越大。与CON组相比，##代表p<0.01。与PF组相比，**表示p<0.01。

图4 葛根治疗PF的网络药理学结果。（A）葛根和PF靶点交叉点的维恩图。（B）葛根的核心成分以及PF通路网络的核心靶点。底部节点表示葛根的105个重叠靶点和PF相关靶点，左侧节点表示16个相关的潜在化合物，右侧节点表示葛根的20个KEGG途径。（C）葛根和PF靶点相交PPI网络。红圈越大，连接程度越高。

5. 葛根对PF作用机制的初步探讨

根据以上结果，我们已经确定了葛根调控的靶点与PF靶点基因之间的重叠基因。为了进一步探索葛根活性成分的多种药效机制，我们在Metascape网站上进行了GO和KEGG功能富集分析，以确定前20个途径（图5A和B）。我们发现这些基因富含精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢，这与从代谢组学分析中获得的结果一致（图3C）。最后，从葛根对PF的组分-靶点-通路调控网络的观点来看，葛根的肺保护机制是多靶点、多途径、全面配合的。

图5 GO和KEGG富集分析。（A）潜在治疗靶点的GO富集分析。（B）潜在治疗靶点的KEGG通路富集分析。气泡图显示KEGG途径富集分析，上述途径均显著富集，颜色由红色逐渐变为白色，表明P值逐渐降低。圆圈的大小意味着映射的蛋白质数量。

6. 基于网络药理学的分子对接

我们从上述数据中获得了葛根在PF治疗中的交叉靶点和主要成分。随后，为了探索葛根在PF上的关键信号分子，并研究活性成分与核心靶点之间的相互作用，我们进行了分子对接。因此，筛选出的六种活性成分与八个核心靶点对接。我们通过Autodock软件计算了8个核心靶点与6个核心组分的最小结合能，如图7所示。在这项工作中，结合能较低显示出较强的结合亲和力和较高的活性。葛根素与NOS2靶点的最低结合能为−9.3 kcal mol−1。此外，其他成分与相应靶点的结合能大多小于−5 kcal mol−1（图6）。结果表明，葛根的核心成分，特别是7，8，4′-三羟基异黄酮和葛根素与核心靶点具有很高的亲和力。最后，我们选择6组进行可视化，包括染料木黄酮和NOS2、葛根素和MMP9、葛根素与TP53、芒柄花素和PTGS2、西托糖苷和FOS、葛根素和TNF-α。总之，最小结合能和可视化结果证明了活性成分，NOS2表现出更强的结合亲和力和更高的活性（图7）。

图6 葛根核心成分与核心靶点的结合能热图

图7 葛根核心成分与核心靶点分子相互连接

7. 联合分析和实验验证

药效学结果表明，葛根能改善PF大鼠的病理症状，尤其是在胶原沉积和呼吸功能方面。此外，网络药理学和分子对接至少表明，葛根通过调节精氨酸代谢途径减轻了BLM诱导的大鼠PF。具体而言，我们证实了NOS2相关信号分子在PF中起着关键作用。在代谢组学中，动物实验表明，与健康大鼠相比，血浆中的氨基酸代谢发生了改变，包括PF大鼠中L-OT浓度升高。上述结果表明，调节精氨酸代谢是缓解PF的一种潜在途径。先前的研究表明，精氨酸新陈代谢、L-OT和NOS2相关信号分子在PF治疗中具有很强的相关性。这些基因分别是与PF相关的关键过程的关键调节因子，包括气道张力、细胞增生和胶原沉积。为了探讨葛根是否通过这一环节来治疗PF，我们对机制进行全面的研究。接下来，我们构建了一个网络，该网络包括活性成分、候选靶点、代谢物相关基因、代谢物和与PF相关的代谢途径（图8A）。随后，我们在网络图中总共鉴定了四个关键靶点（NOS2、TNF-α、MMP-9和NOS3）。进一步的结果表明，葛根可能通过作用于4个候选靶点（NOS2、TNF-α、MMP-9、NOS3）来调节精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢，并影响13个代谢产物相关基因（图8A）。最后，葛根影响了L-OT代谢产物、鞘氨醇和精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢。在这些基因中，NOS2、TNF-α和MMP-9是代谢组学和网络药理学联合分析筛选出参与精氨酸代谢调控的关键基因。

随后，我们进一步探讨了关键靶基因在PF代谢途径和发病过程中的作用。基于KEGG富集结果和先前的研究，我们发现ARG和NOS2可以催化L-ARG转化为L-OT和NO。重要的是，L-OT和NO的过量产生会加重PF。引物设计在表1中。在本研究中，PF大鼠的TNF-αmRNA、MMP-9 mRNA和NOS2 mRNA水平显著升高，而葛根6.4 g/kg和3.2 g/kg组的TNF-βmRNA、MMP-9 mRNA和NOS2 mRNA水平显著降低（P<0.01）（图8B–D）。如图8H和J所示，与对照大鼠相比，PF大鼠的NOS2和L-OT含量更高（p<0.01），并且在PF大鼠中，葛根6.4g/kg和3.2g/kg组明显下调（p<0.01）。进一步的结果显示，与PF组相比，6.4 g/kg和3.2 g/kg组的TNF-α和MMP-9蛋白表达显著降低（P<0.05或P<0.01）（图8E–g）。葛根通过抑制TNF-α、MMP9、NOS2和L-OT的精氨酸代谢相关信号分子来改善PF。此外，生化分析显示，与PF大鼠相比，给予葛根显著降低了NO和羟脯氨酸的含量（P<0.01）（图8I和K）。总之，我们目前的研究结果证实，葛根通过在减少L-OT和NOS2相关信号分子的基础上调节精氨酸代谢途径，减轻了BLM诱导的大鼠PF。

表1 引物序列表

图8 葛根改善PF的多级网络及其实验验证。（A）葛根改善PF的多级网络。（B）TNF-α mRNA的相对水平（n=6）。（C）MMP-9mRNA的相对水平（n=6）。（D）NOS2 mRNA的相对水平（n=6）。（E–G）通过蛋白质印迹法测定MMP-9和TNF-α的蛋白表达（n=3）。（H）大鼠血浆NOS2含量（n=6）。（I）大鼠血浆NO含量（n=6）。（J）大鼠血浆中L-OT含量（n=6）。（K）所有实验组羟脯氨酸含量的比较（n=6）。与CON组比较，##表示p＜0.01，与PF组相比，**表示p<0.01。蓝色、红色、黄色、紫色、绿色和灰色的节点分别代表成分、验证靶点、代谢产物相关基因、差异代谢产物、代谢途径和疾病。

葛根作为一种自古以来就被广泛使用的中草药，被证明具有显著的抗炎、抗纤维化或抗氧化作用。此外，PF作为一种破坏性的进行性肺实质疾病，其病理表现包括肺实质内过量的细胞外基质丝沉积和肺泡上皮细胞逐渐丧失，最终导致胶原沉积、组织塌陷和炎性细胞浸润。一些研究表明，葛根素是通过有效改善代谢功能来治疗肝纤维化的候选药物。例如，一项研究表明，葛根可以通过抗氧化和抑制自由基来抑制纤维化相关疾病的发生。从机制上讲，精氨酸代谢在哮喘、囊性纤维化和肺功能衰竭等肺部疾病的调节中发挥着重要作用。目前，研究表明，L-Arg是NO、不对称二甲基精氨酸和脯氨酸的关键前体，这两种物质在胶原蛋白中富集，并参与PF的发生。羟脯氨酸是胶原蛋白的主要成分，也是ECM积累的标志物。重要的是，我们的生化分析显示，与PF大鼠相比，给予葛根显著降低了羟脯氨酸含量（P<0.01）。此外，与PF大鼠相比，葛根改善了BLM诱导的肺部异常变化、炎症细胞浸润和胶原纤维沉积减少。在这项工作中，我们使用BLM诱导的大鼠纤维化模型，探索了精氨酸代谢途径对葛根在PF中的调节。最后，进一步的结果表明，葛根通过抑制精氨酸代谢相关的信号分子来改善大鼠的PF。

目前，非靶向代谢组学可以分析生物体内所有代谢产物的整体变化，这对发现新的代谢产物和代谢途径尤为重要。众所周知，代谢是指生物体内发生的所有化学反应。例如，几项研究表明，代谢失调和重编程是PF的肺部特征。其中，成纤维细胞的代谢组学异常可导致胶原合成异常和气道重塑失调。研究表明，葛根素通过调节肠道菌群，影响炎症相关氨基酸、脂质和丁酸盐的代谢，从而降低炎症反应，发挥抗骨质疏松作用。在这里，非靶向代谢组学鉴定了12种代谢产物：芍药素-3-芸香糖苷、L-赖氨酸、鞘氨醇、肌酸酐、ureidoisobutyric acid、孕烷四醇酮、莴苣苦素、L-OT、20-羟基二十碳四烯酸、甘草素、12（r）-羟基二十碳三烯酸、柚皮素4′-O-葡糖苷酸，作为治疗PF的差异血浆代谢物。此外，网络药理学可以应用于药物治疗疾病的活性成分和机制。分子对接是一种常见的工具，通常用于探索小分子和大分子之间的相互作用位点。Liu等结合网络药理学、分子对接和分子动力学模拟的结果，发现了泽漆抗肺纤维化的作用机制。在我们的研究中，我们通过网络药理学寻找葛根对抗PF的靶点。进一步研究发现，NOS2、TNF-α、TP53、MMP-9、STAT3、NOS3和FOS被选为葛根治疗PF的主要靶点。特别是NOS2与葛根的活性成分具有最高的亲和力，这揭示了NOS2可以作为精氨酸代谢的靶分子。到目前为止，已经鉴定出三种同工酶亚型，即神经元一氧化氮合酶（nNOS，NOS1）、NOS2和NOS3。每种NOS都是不同的基因产物，在亚细胞定位、组织分布和调节方面与其他NOS不同。此外，网络药理学和代谢组学的研究可以为探索上游靶点、相关途径和功效成分的信息传递提供方向。代谢组学和网络药理学研究表明，人参平肺方抗肺纤维化主要涉及AMPK/PPAR-γ途径。在本研究中，代谢组学和网络药理学的联合分析表明，葛根可能通过作用于4个候选靶点来调节精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢，并影响13个代谢产物相关基因。最后，影响了L-OT的代谢产物、鞘氨醇和精氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸的代谢。

众所周知，精氨酸代谢是指在代谢酶的催化下产生NO、L-OT、尿素和L-瓜氨酸的生化反应。重要的是，L-精氨酸具有几种基本的生物功能，这对免疫反应、胶原蛋白合成、清除血氨和炎症是必要的。例如，新的研究指出，黄芩苷通过与肠道微生物群相关的精氨酸生物合成，减轻耐多药铜绿假单胞菌诱导的急性肺炎大鼠的炎症损伤。相反，阳离子氨基酸转运蛋白（CAT）将饮食、蛋白质周转和内源性合成中的游离精氨酸转运到细胞质中并进行催化。我们的结果表明，精氨酸代谢产物是使用血浆代谢组学获得的。结合之前的联合分析，我们探讨了精氨酸代谢是否与葛根治疗PF的核心靶点相关。具体而言，L-Arg可直接被Arg分解形成L-OT，在鸟氨酸氨基转移酶（OAT）的作用下进一步代谢为L-脯氨酸。同时，NO由不同的NOS异构体从L-精氨酸的末端鸟嘌呤氮产生。L-脯氨酸可促进纤维化和细胞增殖，而异常高浓度的NO可加重PF。NO和L-脯氨酸可能是葛根发挥多种药理作用的重要途径，也是葛根抗纤维化作用的重要机制。此外，据报道，可以同时调节炎症和纤维化反应的药物可能对PF有治疗作用。重要的是，一些报道表明，BLM可以激活核因子κB（NF-κB），上调NOS2和NLRP3，促进肺组织纤维化的发生（图9）。随后的研究表明，减少肺组织中NOS2的表达可以抑制PF。在本研究中，我们发现葛根降低了PF大鼠的血浆NOS2含量。因此，我们探讨了精氨酸代谢相关信号分子的干预是否可以调节PF。在本研究中，我们阐明了葛根通过减少精氨酸代谢途径中NOS2和L-脯氨酸产生，从而抗肺纤维化。一方面，当精氨酸代谢中L-OT含量增加时，肺成纤维细胞的增殖和分化可能被激活，并且由于L-脯氨酸和多胺而增强ECM的合成。另一方面，研究人员证明，支气管肺泡灌洗液中NO浓度异常高，PF小鼠中NOS2过度表达。此外，NOS2的药理学抑制或敲低可以降低PF。我们发现，与对照大鼠相比，PF大鼠的NOS2和L-OT水平更高，并且葛根降低了PF大鼠中L-OT和NOS2的表达。我们确定葛根通过调节L-OT和NOS2的表达来改善PF。显然，葛根至少部分通过精氨酸代谢相关的信号分子来减轻PF。

此外，研究表明，肿瘤巨噬细胞通过IL-1β和TNF-α调节癌症细胞精氨酸代谢，并驱动肿瘤细胞增殖。此外，葛根素通过TNF-α/NF-κB途径调节炎症细胞因子的分泌，并在巨噬细胞水平抑制脂肪组织炎症。促炎细胞因子通过激活NF-κB和其他信号通路来诱导NOS2活性和蛋白质表达，促进NO的产生，从而对肺的急性炎症反应产生影响。MMP-9表达增加可促进ECM的沉积，加速肺纤维化的进展。TNF-α和MMP-9均可刺激炎症因子的表达，促进胶原纤维过度增殖，共同加速肺纤维化的发展。我们的研究发现，葛根降低了PF大鼠肺组织中TNF-αmRNA和MMP-9mRNA的水平。此外，葛根还降低了PF大鼠MMP-9和TNF-α蛋白的表达。因此，葛根对PF的保护作用与促炎细胞因子TNF-α和MMP-9的下调有关。促炎因子的下调有利于精氨酸代谢的负调控。

有越来越多的证据表明，精氨酸代谢与PF之间存在相关性。具体而言，讨论了精氨酸及其相关信号分子，如NOS2、L-OT、NO和L-脯氨酸在PF中的意义，这些信号分子已被证明参与了PF特有的各种过程，包括气道张力功能障碍、胶原沉积和炎症反应增加。这项研究对于理解失调的精氨酸代谢与葛根治疗PF之间的复杂相互作用是非常必要的，它为葛根治疗PF的新潜在代谢生物标志物提供了见解。