急毕业？急晋升？这个思路最适合你！联合网药+分子对接+分子动力学+体内外实验1区|体内外实验|动力学|神经元|细胞|网药|靶点

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中药物质基础成分鉴定及入血分析：

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【正文】

1、本研究先通过网络药理学分析，构建蛋白互作网络与生信分析预测了潜在靶点与信号通路；

2、本研究通过体内与体外实验对预测结果进行了验证与评估。研究AS对MPTP诱导的小鼠PD的影响，通过评估神经炎症和NLRP3炎性小体的激活来确认AS的抗炎特性。通过BV2细胞体外实验，探讨AS在PD中的作用机制；

3、本研究还进行了 CETSA、分子对接和分子动力学模拟 (MDs)来进一步验证。

4、本研究结果表明，AS与NLRP3结合，可有效抑制炎症的组装与激活。

题目：积雪草苷通过靶向NLRP3炎症小体激活发挥神经保护作用

杂志：Phytomedicine

影响因子：IF=7.9

发表时间：2024年3月

研究背景

帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，其特征是由于黑质（SN）和纹状体（STR）中多巴胺能神经元的逐渐丧失以及神经炎症而引起的运动症状。积雪草苷（AS）是一种具有抗炎和神经保护特性的主要活性成分，来源于积雪草。然而，AS影响炎症相关PD的确切机制尚不完全清楚。本研究旨在探索PD中AS的保护机制。

研究思路

本研究先通过网络药理学分析，预测了潜在靶点与信号通路，再通过体内与体外实验对预测结果进行了验证与评估，最终得到结论积雪草苷与NLRP3结合，可有效抑制炎症的组装与激活。

主要结果

网络药理学预测AS对PD作用靶点和潜在通路

使用预测、组合方法和PharmMapper数据库共预测了95个AS的潜在目标（图1B）。其中，17个治疗靶点是通过与1147个PD相关靶点的交叉点确定的（图1C和D）。为了分析这些目标之间的相互作用，根据数据构建了一个由17个节点和49个边缘组成的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（图1E）。主要目标包括NFκB1、TLR4、MAPK1和NLRP3。进行了GO富集分析，以评估AS靶点的生物功能，包括细胞成分、分子功能和生物过程（图1F）。此外，KEGG富集分析确定了149条途径。前25条富集通路表明，AS可能通过多种信号通路影响PD，包括NOD样受体、C型凝集素再受体和IL-17信号通路（图1G）。

AS改善MPTP诱导的PD小鼠的运动功能障碍

为评价AS对PD模型小鼠的神经保护作用，采用开场试验评价其运动功能。在本实验中，以10 mg/kg和60 mg/kg体重给药的AS显著减轻了MPTP引起的运动功能障碍，表现为小鼠的平均速度和总行驶距离的恢复（图2B，2C）。观察小鼠运动模式，MPTP处理的小鼠表现出活性下降，其运动主要集中在开放区域的中心，AS治疗表现出明显更大的活动范围（图2D）。这些发现共同表明，AS具有逆转MPTP影响小鼠运动功能障碍的强大能力。

AS减轻了MPTP诱导的PD小鼠的多巴胺能神经元损失

MPTP治疗诱导多巴胺能神经元进行性变性，SN和STR神经递质显著减少，这是PD的标志性特征。MPTP给药后，SN和STR的多巴胺能神经元数量显著减少，这种作用的特点是TH阳性神经元的损失，表明多巴胺能神经元损伤。AS治疗减轻了这些影响，证明了STR和SN中TH阳性神经元数量的保留(图3D和E)。此外，AS恢复了MPTP诱导的PD小鼠STR和SN脑区TH的表达(图3A和B)。PD小鼠SN中Iba1阳性细胞(活化的小胶质细胞)显著增加(图3F)，这是MPTP诱导的神经炎症的标志。AS治疗降低了SN中的小胶质细胞激活和Iba1表达(图3C和F)，突出了其在缓解PD神经炎症中的潜在作用。总的来说，这些发现表明AS对PD小鼠主要通过抑制神经炎症而起到保护作用。

AS抑制小胶质细胞中的NLRP3炎症体激活

采用LPS联合ATP的体外模型，验证AS对NLRP3炎性小体激活的直接作用。实验前期验证表明AS在浓度为200 μM时对细胞无毒。BV2细胞用1 μg/ml LPS孵育3小时，随后用2.5 mM ATP孵育1小时，表现出明显的NLRP3炎性体活化(图4B)。在LPS暴露前，用不同浓度的AS预处理BV2细胞1小时，可显著降低上清液中p17和p20的水平(图4B)，这表明AS抑制NLRP3炎性体的激活，减少细胞因子IL-1β的释放。此外，AS治疗并没有降低NLRP3、pro-caspase 1和pro-IL -1β的表达(图4B)。经RT-qPCR分析，AS不影响LPS诱导的NLRP3和IL-1β mRNA水平升高（图4C，4D）。基于此，假设AS可能通过直接结合NLRP3蛋白来抑制NLRP3炎性体的组装，并通过CETSA验证。结果表明，虽然温度升高促进了NLRP3蛋白的分解，但AS的存在减轻了这种降解(图4E)。因此，得出结论，AS通过与NLRP3蛋白的直接相互作用阻碍NLRP3炎性体的激活。

分子对接研究和分子动力学

通过分子对接，阐明AS与NLRP3可能的结合模式。经MOE软件分析，AS的平均S-score值为-10.71 kcal/mol，最低RMSD值为1.75 Å，表明该化合物具有较高的亲和力。利用整体对接图和三维相互作用图对综合体的对接图进行详细分析，结果表明，AD与NLRP3的活性位点结合，氢键和疏水相互作用在结合过程中起主要作用(图5A和B)。此外，AS与NLRP3相互作用的预测Ki值最高，为33.77 μM。

了探索蛋白质-配体复合物的稳定性和动态相互作用，进行了MDs来验证对接模拟结果，并分析NLRP3在配体结合后的分子运动。对接复合物进行了100 ns的模拟，在此过程中温度、动能和势能保持稳定(图5E和F)，在MD模拟过程中RMSD值波动较小，表明对接姿态是可靠的。此外，对上述配合物的结合自由能进行了计算，用MM/PBSA法和MM/GBSA法计算了配合物的总结合自由能，得到的绝对值(-59.80和-59.56 kcal/mol)是一致的。这表明AD与NLRP3具有较强的结合能力。VDW和EE能量对结合有很大贡献。为了确定参与NLRP3蛋白结合的关键氨基酸残基，对氨基酸残基进行了能量分解。图5C显示了能量贡献值低于- 1 kcal/mol的氨基酸残基，表明ARG578、PRO352和ALA228是结合自由能的主要贡献者。