中科院1区: 左归降糖益肾方通过mROS-NLRP3轴干预三甲胺n-氧化物诱导的焦亡预防糖尿病肾病|三甲胺|中科院|大鼠|心血管疾病|糖尿病肾病|肾脏|血清

左归降糖益肾方通过mROS-NLRP3轴干预三甲胺n-氧化物诱导的焦亡预防糖尿病肾病

目前，糖尿病肾病（DKD）已成为对终末期肾脏疾病威胁最大的疾病之一，对糖尿病患者进行早期预防势在必行。本文中，作者发现左归降糖益肾方可通过调节糖脂代谢紊乱、改善肾功能和延缓肾脏病理变化来预防糖尿病肾病的进展。此外，肠道来源的三甲胺n-氧化物（TMAO）可以通过激活mROS-NLRP3轴来诱导细胞焦亡，从而促进糖尿病肾病。而左归降糖益肾方可通过调节肠道微生物群干扰TMAO的产生，并在高糖环境中抑制TMAO诱导的细胞焦亡，从而预防糖尿病肾病。

本文“Zuogui-Jiangtang-Yishen decoction prevents diabetic kidney disease: Intervene pyroptosis induced by trimethylamine n-oxide through the mROS-NLRP3 axis”由湖南中医药大学喻嵘和黄健华团队于2023年3月发表于Phytomedicine杂志。

研究背景

全球有超过4.5亿人患有糖尿病，到2045年将增加到7亿以上[1]。糖尿病患者的微血管变化通常会导致DKD[2]。一般来说，DKD的诊断标志是尿微量白蛋白，如果不进行早期干预，大约50%的DKD患者会发展为巨量蛋白尿，进而极有可能发展为终末期肾病[3]。因此，预防DKD的发展对糖尿病患者至关重要。

焦亡是一种程序性细胞死亡，其介导的肾脏炎症有助于DKD的早期肾损伤。据报道，肾功能下降与焦亡调节分子的浓度有关。典型的焦亡表现为细胞内NLRP3炎症小体表达增加和Caspase-1活化[4]。在DKD的进展过程中，NLRP3炎症小体信号通路的激活有助于焦亡，并强烈影响肾功能[5]。值得注意的是，高血糖、脂肪酸和其他有害分子可以被特定的模式识别受体识别并诱导焦亡[6]。因此，干预相关有害分子引起的焦亡可能是预防DKD的关键。

肠道菌群及其代谢物的失调与糖尿病及其并发症有关[7]。“肠-肾”轴在肾脏疾病的发病机制中引起了广泛关注。TMAO作为一种肠道来源的低分子尿毒症毒素，与心血管疾病和DKD的发展有关[8]。高脂肪饮食或饮食中补充胆碱或TMAO可促进肾小管间质纤维化，增加促纤维化基因和肾损伤标志物的表达[9]。此外，TMAO对心血管事件和全因死亡风险具有独特的临床预后价值[10]。线粒体功能异常会促进线粒体活性氧的产生，这是导致焦亡的一个重要原因。研究表明，TMAO增加线粒体活性氧的产生并促进NLRP3炎症小体的组装激活，从而诱导细胞焦亡[11]。

中医在中医理论的指导下治疗疾病已有几千年的历史。中药复方成分复杂，具有多组分、多途径、多靶点的特点。此外，中药可以同时调节肠道菌群代谢，从而起到治疗疾病的作用。左归降糖益肾方是根据中医经典名方左归丸优化而成的临床治疗DKD的中药复方。初步临床研究发现，左归降糖益肾方可改善DKD患者异常糖脂代谢，降低氧化应激损伤、尿微量白蛋白和轻度炎症。此外，左归降糖益肾方能够通过改善早期糖尿病肾损伤来抑制炎症因子、氧化应激、肾小球系膜细胞增殖和足细胞损伤。

实验内容

Result1 左归降糖益肾方的质量控制与鉴定

本文从左归降糖益肾方中鉴定出腺苷、京尼平苷酸、莫诺苷、马钱苷、盐酸药根碱、小檗碱、黄藤素、蜕皮激素和异槲皮苷（图1A），并定量分析了马钱苷、小檗碱、黄藤素和盐酸药根碱四种成分。随后，作者采用GK大鼠自发性2型糖尿病模型来探讨药物对肾功能损伤的预防作用（图1B）。结果表明，GK大鼠给予左归降糖益肾方治疗6周后可显著抑制空腹血糖的升高，并降低血清果糖胺、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇（LDL-C/HDL-C）水平（图2A、B）。更重要的是，左归降糖益肾方可以显著改善GK大鼠肾功能指标的异常（图2C）。作者进一步观察中药复方左归降糖益肾方对大鼠肾组织病理改变的预防作用。H&E和PAS染色显示，在使用左归降糖益肾方或二甲双胍+达格列净后，DKD的病理特征得到改善（图2D）。此外，左归降糖益肾方还能改善肾小球基底膜的增厚（图2E）。各组9项生化指标聚类分析结果一致表明，左归降糖益肾方能以剂量依赖的方式改善糖脂异常，并在一定程度上减轻肾损伤（图2F）。

图1 左归降糖益肾方质量控制和实验动物设计。（A）左归降糖益肾方的HPLC色谱分析。（B）整体动物实验设计。

图2 左归降糖益肾方对GK大鼠糖脂紊乱及肾功能损害的预防作用。（A）左归降糖益肾方对GK大鼠的血糖调节作用，包括空腹血糖和血清果糖胺。（B）血脂调节作用，包括血清TC、血清TG、血清LDL-C/HDL-C。（C）肾功能指标，包括尿白蛋白/血清肌酐、尿白蛋白、尿β2-M、血清肌酐和血清尿素。（D）肾组织的H&E染色和PAS染色。（E）肾组织超微结构透射电镜。黄色箭头表示肾小球毛细血管腔内的玻璃样改变；红色箭头:肾小球基底膜增厚。（F）各大鼠与9项生化指标相关性分析热图。

Result2 左归降糖益肾方干预焦亡的潜在机制：干预mROS-NLRP3轴

接下来，作者进一步研究了左归降糖益肾方抗焦亡的潜在机制。结果显示，GK大鼠的TUNEL阳性细胞比例明显高于Wistar大鼠（图3A、B）。GK大鼠参与焦亡发生的关键因子NLRP3、GSDMD、Caspase 1以及焦亡过程中产生的两种主要细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）显著增加（图3C-L）。此外，考虑到受损线粒体促进mROS的释放可激活NLRP3炎症小体而导致细胞焦亡，作者采用透射电镜观察线粒体的微观结构。结果显示，GK大鼠线粒体形态发生改变（图3M）。此外，调节线粒体功能和ROS产生的两个线粒体功能标志物Ndufs1和Ndufv1的水平在左归降糖益肾方干预后得到明显改善，提示左归降糖益肾方对mROS-NLRP3轴诱导的细胞焦亡的干预可能是其肾脏保护机制之一。

图3 左归降糖益肾方抑制肾组织焦亡，改善线粒体功能。（A-B）TUNEL染色检测肾组织焦亡率。（C-E）采用免疫组化方法检测NLRP3和GSDMD在肾组织中的表达及其平均光密度。（F-G）Western Blotting中Caspase 1、IL-1β和IL-18的相对蛋白表达。（H-L）肾组织NLRP3、GSDMD、Caspase 1、IL-1β、IL-18 的mRNA的相对表达量。（M）肾小管上皮细胞线粒体透射电镜。（N-O）两种线粒体标志物Ndufs1和Ndufv1的相对mRNA表达量。

Result3 左归降糖益肾方干预TMAO代谢的靶向验证

接下来，为了研究左归降糖益肾方与肠道微生物群的相互作用，作者建立了模拟体内肠道厌氧环境的粪便细菌发酵模型。采用UPLC-MS法对来自5个不同处理组的粪便细菌的发酵液中的三甲胺（TMA）进行靶向检测（图4A），结果显示，左归降糖益肾方在发酵24～48小时内对TMA的生长有明显的抑制作用（图4B）。此外，左归降糖益肾方还可显著抑制血浆和肾脏中的TMAO水平。

胆碱三甲胺裂解酶（cutC）基因在特定肠道细菌中表达，可将胆碱编码为TMA。因此，接下来作者检测了cutC基因的表达。结果显示，服用左归降糖益肾方后，GK大鼠的cutC的mRNA水平和粪便中的TMA水平均下降，表明左归降糖益肾方可能通过干扰特定细菌的丰度来影响cutC的表达（图4C、E）。在人体中，超过95%的TMAO可以通过FMO3氧化TMA为TMAO通过血液循环代谢到肾脏。然而，左归降糖益肾方也能抑制肝脏FMO3水平（图4D）。此外，左归降糖益肾方还能抑制血浆和肾脏中的TMAO水平（图4D）。

图4 左归降糖益肾方干预TMAO代谢的靶向验证。（A）粪便细菌体外发酵实验过程。（B）发酵48 h后各组发酵液中TMA的增加率（n=3/组）。（C）粪便中cutC基因mRNA的表达。（D）肝脏FMO3水平。（E）各组大鼠TMAO代谢产物的靶向检测，包括粪便TMA、血浆TMAO和肾脏TMAO水平。

Result4 左归降糖益肾方治疗改变了GK大鼠肠道菌群组成

肠道微生物群和TMAO代谢紊乱可能是细胞焦亡的潜在因素，因此，作者接下来进行了肠道微生物群分析。根据Chao 1和Shannon指数，高剂量左归降糖益肾方可显著增加GK大鼠的alpha多样性（图5A）。PCoA分析的OTU水平的beta多样性在六组之间也显示出显著差异（图5B）。上述结果表明，左归降糖益肾方具有调节菌群结构的作用。此外，分类学分析显示，每组在门水平上的相对肠道微生物群丰度不同（图5C）。基于上述结果，作者在后续工作中重点研究高剂量左归降糖益肾方对肠道菌群调节的影响。在LEfSe分析中，CON、MOD、POS和左归降糖益肾方高剂量组之间共筛选出47个差异菌属，左归降糖益肾方可显著调节8个菌属，包括Bacteroides，Blautia，Romboutsia，Parabacteroides，Ruminococcus_torques_group，Alistipes，Fusicatenibacter和Lactobacillus（图5D-E）。采用随机森林算法对MOD与高剂量组差异菌群进行深度筛选，将13个新的差异属富集为两组（图5F）。值得注意的是，这两种算法都能识别Sutterella和Turicibacter，这两种算法分别与DKD的发生和糖脂代谢调节有关。此外，高左旋肉碱摄入时，Erysipelatoclostridium、Faecalibaculum和Erysipelotrichaceae呈阳性，而高脂肪饮食会导致Turicibacter和Alistipes的减少。在这些差异属中，Bacteroides，Ruminococcus，Parabacteroides，Faecalibaculum和Blautia等细菌与TMAO的产生呈正相关。相反，Lactobacillus对TMAO和TMA有负面影响。

图5 16S rRNA测序显示左归降糖益肾方处理后微生物群组成发生改变。（A）alpha多样性包括ACE、Chao 1和Shannon指数。（B）PCoA分析中OTU水平的beta多样性。（C）左归降糖益肾方在门水平上对肠道菌群调节的影响。（D）CON、MOD、POS和ZG-H组肠道菌群组成及LEfSe分析生成的枝状图。（E）ZG-H对8种不同肠道菌群调节的影响。（F）随机森林算法筛选MOD组和ZG-H组之间的差异菌群。

Result5 肠道菌群的潜在相关性及代谢途径分析

为了阐明微生物之间的相互作用，作者计算了前30个细菌的拓扑特征值，筛选出了左归降糖益肾方高剂量组的关键属。相关网络共有29个节点和48条边，其中NK4A214_group（DC=6，BC=0.24，CC=0.34），Ruminococcus（DC=5，BC=0.26，CC=0.35），Clostridia_UCG-014（DC=5，BC=0.07，CC=0.30），Christensenellaceae_R-7_group（DC=5，BC=0.07，CC=0.30），Treponema（DC=5，BC=0.23，CC=0.31）和Blautia（DC=4，BC=0.23，CC=0.28）是关键属（图6A）。作者进一步分析差异菌群与生化指标的相关性（图6B）。相关热图显示，Turicibacter与9项指标均呈显著负相关；Lactobacillus与糖脂代谢和尿白蛋白呈负相关；Frisingicoccus、Faecalitalea和Helicobacte分别与FRUC、TC+ACR、TG呈负相关；Allobaculum与FRUC和TC呈负相关。相反，Sutterella和Treponema与DKD相关的大部分生化指标呈正相关，Fusicatenibacter可能促进GK大鼠的β2-M水平。这些结果表明评估肠道微生物群对GK大鼠的潜在影响。

接下来，作者测定了MOD高剂量组与左归降糖益肾方高剂量组之间的代谢途径。作者采用火山图来筛选不同的代谢途径。结果表明，左归降糖益肾方干预后，12条差异通路出现显著抑制（图6C）。其中色氨酸代谢、血流剪切应力和动脉粥样硬化、MAPK信号通路、n-聚糖生物合成、溶酶体和肌醇磷酸代谢在DKD的发生发展中表现出重要作用。值得注意的是，TMAO是饮食前体胆碱的产物。据报道，胆碱代谢和MAPK信号通路抑制可能对TMAO的产生和TMAO诱导的肾损伤有重要影响。结合粪便发酵实验，提示左归降糖益肾方可调节GK大鼠肠道微生物源TMAO代谢产物。

图6 肠道菌群的潜在相关性及代谢途径分析。（A）ZG-H组前30个丰度的肠道菌群相关网络，节点代表细菌，节点之间的线为边。节点之间的线表示Spearman相关，颜色强度表示相关系数（绿色，正；灰色，阴性）。（B）生化指标与差异微生物群相关的聚类热图。（C）火山图代谢途径筛选。

Result 6 左归降糖益肾方减轻TMAO诱导的焦亡作用的体外验证

最后，作者使用HK-2细胞进一步研究TMAO对细胞焦亡的促进作用以及左归降糖益肾方的调节作用。结果表明，在25 mM高糖（HG）条件下，当细胞暴露于TMAO（200 μM）48 h时，细胞活力明显下降（图7A）。而左归降糖益肾方含药血清可显著抑制高糖条件下TMAO诱导的细胞死亡（图7B），此外，左归降糖益肾方还可通过抑制细胞内ROS的产生来干预细胞焦亡（图7C）。因此，作者采用荧光探针检测细胞内ROS水平（图7E、F）。通过扫描电子显微镜观察，HG+TMAO处理后细胞出现肿胀、细胞表面绒毛减少、细胞膜上形成大量焦体和气孔，而这些变化在乙酰半胱氨酸和左归降糖益肾方药物血清处理后得到改善（图7D）。最后，作者用免疫荧光法检测各组NLRP3表达，同样发现HG+TMAO使NLRP3表达升高，而左归降糖益肾方和乙酰半胱氨酸抑制NLRP3表达（图7G、H）。这些观察结果进一步支持了TMAO诱导焦亡的作用，证明左归降糖益肾方除了对其菌群和TMAO的调控作用外，还具有干预焦亡的作用。

图7 左归降糖益肾方对TMAO诱导的焦亡有抑制作用。（A-B）不同浓度梯度下TMAO和左归降糖益肾方药物血清的细胞活力。（C）各组焦亡率的Annexin V/PI染色。（D）扫描电镜下细胞的焦亡形态，白色箭头为细胞膜上出现的气孔。（E-F）DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平。（G-H）NLRP3表达的免疫荧光。

总结与讨论

DKD是2型糖尿病的常见并发症之一，由肾小球滤过率下降、尿白蛋白排泄率增加或两者兼有引起。如今，微量白蛋白尿被认为是DKD的预测因子，然而，几项前瞻性纵向研究表明，微量白蛋白尿和血清肌酸酐都是不敏感和非预测性指标，因为只有当出现严重肾损伤时，血清肌酸酐水平才会增加约40%至50%。因此迫切需求寻找更好的用于DKD早期诊断的生物标志物。

肠道来源的尿毒症毒素在过去几年中一直是深入研究的主题。TMAO被认为是心血管疾病、糖尿病和代谢事件的风险指标。TMAO可损害线粒体的结构和功能，增加mROS的产生并促进NLRP3炎症小体的组装激活，从而诱导细胞焦亡。然而，TMAO是如何调节DKD和肾细胞的，却很少被讨论。本研究证明了TMAO可通过诱导细胞焦亡从而促进DKD的进展，可作为DKD的潜在生物学预测指标，为DKD的预防和治疗提供理论依据。

中药复方成分复杂，这意味着其在治疗疾病时，可以通过多成分、多途径、多靶点来发挥作用，从而实现更全面的治疗效果，因此对于中药复方发挥疗效的机制研究意义重大。在这项研究中，左归降糖益肾方可显著改善糖尿病大鼠的糖脂代谢紊乱及肾脏病理变化，并且可通过调节肠道微生物群干扰TMAO的产生，并在高糖环境中抑制TMAO诱导的细胞焦亡，从而预防糖尿病肾病。当然，还需要更多的临床研究来支持左归降糖益肾方对DKD的预防作用。首先，筛选出的与TMAO密切相关的细菌需要进一步验证。此外，左归降糖益肾方对这些关键细菌的调控作用需要在今后的工作中进一步证明。最后，其他微生物来源的尿毒症毒素是否影响DKD的发展还需要进一步研究。

参考文献

[1] Thomas B. The Global Burden of Diabetic Kidney Disease: Time Trends and Gender Gaps[J]. Curr Diab Rep, 2019,19(4):18.

[2] Anders H J, Huber T B, Isermann B, et al. CKD in diabetes: diabetic kidney disease versus nondiabetic kidney disease[J]. Nat Rev Nephrol, 2018,14(6):361-377.

[3] Berhane A M, Weil E J, Knowler W C, et al. Albuminuria and estimated glomerular filtration rate as predictors of diabetic end-stage renal disease and death[J]. Clin J Am Soc Nephrol, 2011,6(10):2444-2451.

[4] Shi J, Gao W, Shao F. Pyroptosis: Gasdermin-Mediated Programmed Necrotic Cell Death[J]. Trends Biochem Sci, 2017,42(4):245-254.

[5] Lin J, Cheng A, Cheng K, et al. New Insights into the Mechanisms of Pyroptosis and Implications for Diabetic Kidney Disease[J]. Int J Mol Sci, 2020,21(19).

[6] Hutton H L, Ooi J D, Holdsworth S R, et al. The NLRP3 inflammasome in kidney disease and autoimmunity[J]. Nephrology (Carlton), 2016,21(9):736-744.

[7] Bordalo T L, Dos S K, De Luces F F C, et al. Gut microbiota and probiotics: Focus on diabetes mellitus[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 2017,57(11):2296-2309.

[8] Arias N, Arboleya S, Allison J, et al. The Relationship between Choline Bioavailability from Diet, Intestinal Microbiota Composition, and Its Modulation of Human Diseases[J]. Nutrients, 2020,12(8).

[9] Tang W H, Wang Z, Kennedy D J, et al. Gut microbiota-dependent trimethylamine N-oxide (TMAO) pathway contributes to both development of renal insufficiency and mortality risk in chronic kidney disease[J]. Circ Res, 2015,116(3):448-455.

[10] Schiattarella G G, Sannino A, Toscano E, et al. Gut microbe-generated metabolite trimethylamine-N-oxide as cardiovascular risk biomarker: a systematic review and dose-response meta-analysis[J]. Eur Heart J, 2017,38(39):2948-2956.

[11] Wu P, Chen J, Chen J, et al. Trimethylamine N-oxide promotes apoE-/- mice atherosclerosis by inducing vascular endothelial cell pyroptosis via the SDHB/ROS pathway[J]. J Cell Physiol, 2020,235(10):6582-6591.

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0944711323001368

DOI：10.1016/j.phymed.2023.154775

指导老师：狄留庆、张雯

排版编辑：柴晓倩、王萍

稿件审阅：张雯

中药物质基础、成分鉴定及入血分析：