本次实验的目的是使用CoIP-MS或者CoIP-WB的方法,通过在目的细胞中运用针对目标蛋白的抗体把相应的蛋白-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化并对结合在复合物上的蛋白进行MS或WB分析寻找目标蛋白相互作用的蛋白,或在不同遗传背景或处理条件下的互作变化。
广州基云生物拥有经验丰富的技术团队,提供专业的研究方案、严格项目质控、科学的数据分析,为互作机制提供专业建议,助力快速获取互作机制分子,突破互作机制研究瓶颈难题。关于免疫沉淀试验相关问题,欢迎大家踊跃留言共同探讨。
CoIP实验方法步骤详解:
一、细胞的收集及裂解
1. 收集2E7个细胞样品,加入PBS洗涤细胞,离心后弃上清收集细胞沉淀。
2. 准备500 μl 预冷的 Cell Lysis Buffer,分别加入5 μl Protease Inhibitor、5 μl PMSF,混匀后加进细胞沉淀中吹打均匀,冰上孵育 30 min,期间涡旋混匀几次。
3. 4℃,12000 rpm 离心10 min,取上清,进行蛋白浓度测定及后续实验。
二、免疫复合物的制备
1. 在离心管中,将每个样品的细胞裂解液与 2-10 μg 免疫沉淀抗体结合。每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为 500-1000 μg,由 Pierce BCA Protein Assay蛋白浓度检测试剂盒测定。
2. 用免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液将抗体/裂解液稀释至 500 μL。
3. 在室温下孵育 1-2 h,或 4℃过夜,以形成免疫复合物。
三、免疫沉淀
1. 将 25 µL (0.25 mg) 的 Pierce 蛋白 A/G 的磁珠加入1.5 mL 离心管中。
2. 向磁珠中加入 175 µL 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液,轻微涡旋混匀。
3. 将离心管放入磁力架中收集磁珠到离心管的一边。去除上清。
4. 向离心管中加入 1 mL 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液。颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min。用磁力架收集磁珠。去除上清。
5. 将抗原样品/抗体混合物加入盛有磁珠的离心管中,保持混匀室温下孵育1 h。
6. 用磁力架收集磁珠,除去未结合的样品,保存以备分析。
7. 向离心管中加入500 µL 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液,轻柔混匀。收集磁珠,弃上清。再重复洗两次。
8. 向管中加入 500 µL 超纯水,轻柔混匀。用磁力架收集磁珠,弃上清。
9. 低 pH 洗脱:向离心管中加入 100 µL 洗脱液。保持混匀在室温下孵育离心管 10 min。 通过磁力分离磁珠,保留含有目的抗原的上清。每 100 µL 洗出液中加入 10 µL 中和液来中和低 pH。 备选洗脱方法:向离心管中加入 100 µL 1X电泳上样缓冲液,将样品置于加热器中, 96- 100℃加热 10 min。通过磁力架分离磁珠,保留含有目的抗原的上清。
四、Western检测目的蛋白
1. 配胶。
2. 上样,跑电泳,恒压100 min。
3. 转膜,湿转250 mA恒流转1-2 h。
4. 封闭,将PVDF膜放入5%的脱脂牛奶中,封闭1 h。
5. 孵育一抗(PBS稀释),4℃孵育过夜。
6. TBST洗膜3次,每次5 min。
7. 孵育二抗(TBST稀释),室温孵育1 h。
8. TBST洗膜3次,每次5 min。
9. 按1:1的比例将ECL发光液均匀滴到膜上
10. 曝光,显影,定影。
五、银染
1. 固定:电泳结束后,取凝胶放入约100 ml 固定液中,在摇床上室温摇动20 min,摇动速度为60-70 rpm。固定40 min以上甚至过夜可以进一步降低背景。
2. 30%乙醇洗涤:弃固定液,加入100 ml 30%乙醇,在摇床上室温摇动10 min,摇动速度为60-70 rpm。
3. 水洗涤:弃30%乙醇,加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水, 在摇床上室温摇动10 min,摇动速度为60-70rpm。如果本步骤用水洗涤更长时间,对降低染色的背景略有帮助。
4. 增敏:弃水,加入100 ml 银染增敏液(1X),在摇床上室温摇动2 min,摇动速度为60-70 rpm。
5. 水洗涤(共2次):弃原有溶液,加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动1 min,摇动速度为60-70 rpm。弃水,再加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动1 min,摇动速度为60-70 rpm。
6. 银染:弃水,加入100 ml 银溶液(1X),在摇床上室温摇动10 min,摇动速度为60-70 rpm。
7. 水洗涤:弃原有溶液,加入100 ml Milli-Q级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动1-1.5 min,摇动速度为60-70 rpm。注意:水洗涤的时间不能超过1.5 min。
8. 显色:弃水,加入100 ml银染显色液,在摇床上室温摇动3-10 min,直至出现比较理想的预期蛋白条带,摇动速度为60-70 rpm。
9. 终止:弃银染显色液,加入100 ml 银染终止液(1X),在摇床上室温摇动10 min,摇动速度为60-70 rpm。
10. 水洗涤:弃银染终止液,加入100 ml Milli-Q级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动2-5 min,摇动速度为60-70 rpm。
11. 保存:可在Milli-Q级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。
六、Western检测结果
1.WB验证抗体质量(质控1)
例如:
结果说明:WB检测目的样本中有目的蛋白的信号,说明抗体有效以及蛋白没有发生降解。
2.IP产物WB检测(质控2)
例如:
结果说明:KIF2C抗体能把自身蛋白特异性富集下来(质控),以及能特异性结合TBC1D7(WB验证候选互作蛋白);同时反向验证TBC1D7抗体能把自身蛋白特异性富集下来(质控),以及能特异性结合KIF2C(WB验证候选互作蛋白)。
七、质谱结果
1.银染结果(质控3)
例如:
结果说明:银染结果显示有差异条带,可进行后续MS分析。
参考文献:
KIF2C: a novel link between Wnt/β-catenin and mTORC1 signaling in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma.”Protein & cellvol. 2021.
热门跟贴