中科院1区-湖北中医大揭示菊花调节肠菌和PPARα/γ通路减轻代谢性和酒精相关肝病|ppar|中科院|代谢性|代谢物|内源性|大鼠|心血管疾病|湖北省|肝病|肠菌|血清|酒精

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

代谢性和酒精相关肝病（MetALD）在肝脏患者中的患病率很高，但目前还没有有效的治疗方法。作为一种食用中草药，菊花水提取物（WECM）具有抗炎、抗氧化和保肝的特性。然而，其对MetALD的治疗作用及其相关机制尚不清楚。本研究旨在分析WECM改善MetALD的潜在机制，采用高脂高糖加酒精饮食（HFHSAD）建立MetALD大鼠模型，并用WECM进行给药处理；通过血清和肝脏生化标志物测量、组织病理学切片分析、16S rDNA测序和非靶向血清代谢组学分析，确定了疗效并预测了WECM改善MetALD相关的途径；通过RT-PCR和蛋白质印迹检测过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）和γ（PPARγ）信号通路中基因和蛋白质的变化。WECM可显著减轻MetALD大鼠的肝脂肪变性、高脂血症和肝损伤标志物；并且改善了血管内皮功能、高血压和系统氧化应激。从机制上分析，WECM通过维持厚壁菌门/拟杆菌门的比例和减少有害菌的丰度，如梭菌、Faecalibaculum和Herminiimonas，改变了肠道微生物群的整体结构。WECM促进15-脱氧-△12，14-前列腺素J2（15d-PGJ2）的释放，并进一步激活PPARγ以降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平。WECM还可上调PPARα，下调CD36和FABP4水平，以改善脂质代谢。本研究首次证明，WECM通过调节肠道微生物群和激活15d-PGJ2/PPARγ和PPARα信号通路，显著改善了MetALD大鼠的肝脏脂肪变性、氧化应激和炎症。

亮点：

1.WECM处理可改善MetALD大鼠的肝脏脂肪变性、氧化应激和炎症。

2.WECM 改变了肠道微生物群组成，尤其是恢复了MetALD大鼠的厚壁菌门/拟杆菌门比例。

3.WECM促进15d-PGJ2释放，并进一步激活PPARγ以抑制MetALD大鼠的系统炎症。

4.WECM上调PPARα并下调CD36和FABP4以减少MetALD大鼠肝脏中的脂质积累。

论文ID

原名：Chrysanthemum morifolium attenuates metabolic and alcohol-associated liver disease via gut microbiota and PPARα/γ activation

译名：菊花通过肠道微生物群和PPARα/γ激活来减轻代谢性和酒精相关的肝脏疾病

期刊：Phytomedicine

IF：7.9

发表时间：2024.05

通讯作者：叶晓川&刘丹

通讯作者单位：湖北中医药大学

实验设计

实验结果

1. WECM的化学成分

我们采用UPLC-Q-TOF-MS对WECM的化学成分进行了分析。通过裂解途径分析、参考文献比较和文献检索相结合，我们共鉴定出38种化合物，包括26种黄酮类化合物和12种有机酸（图1）。

图1 使用UPLC-Q-TOF-MS分析WECM的化学概况。（A-D）WECM在负（A）和正（C）离子模式下的总离子色谱图，在负（B）和正（D）离子模式下混合标准溶液的总离子色谱图。（E-G）已鉴定化合物的色谱图。

2. WECM减轻MetALD大鼠肝脏脂肪变性和活损伤

大鼠的肝脏组织学变化如图2B所示，我们观察到弥漫性肝脏脂肪浸润和肝细胞积水变性。此外，模型组肝组织内的肝索和肝小叶结构被破坏。与模型组相比，WECM组的肝组织在WECM处理后脂肪浸润面积减少，肝小叶结构部分恢复，表明口服WECM可显著减轻MetALD大鼠的病理变化。与模型组相比，WECM给药大鼠的肝脏指数显著降低（图2C）。

与对照组相比，模型组的血清低密度脂蛋白（LDL-C）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）含量显著增加（图2D–H）。所有WECM给药大鼠的血清LDL-C水平均显著降低（图2D）。WECM-H（高剂量）组血清TC水平明显下降。相反，WECM-L（低剂量）和WECM-M（中剂量）组的TG和AST水平显著降低，WECM-L和WECM-H组的ALT水平显著降低（图2E–H）。就肝脏脂质水平而言，模型组的TC、TG和AST水平显著升高，而ALT含量下降。与模型组相比，所有给药组的TC和TG水平均显著降低。WECM-L和WECM-M组的AST水平显著下降，WECM-M和WECM-H组的ALT水平升高（图2I-L）。这些数据表明，WECM减轻MetALD大鼠的肝脏脂肪变性并改善肝功能。

图2 WECM减轻了MetALD大鼠的肝脏脂肪变性和活损伤。（A）动物实验设计。（B）肝脏HE染色（×200，黑色箭头表示变性；黄色箭头表示脂泡）。（C）肝脏指数。（D-H）血清LDL-C（D）、TC（E）、TG（F）、AST（G）和ALT（H）水平。（I-L）大鼠肝组织TC（I）、TG（J）、AST（K）和ALT（L）水平（n=8）。数据代表平均值±标准差。与对照组相比，##p＜0.01，#p＜0.05。与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01（所有p值均通过Student t检验获得）。

3. WECM改善MetALD大鼠的血管内皮功能，降低BPs并改善氧化应激

如图3A所示，与对照组相比，模型组大鼠的膜剥落和胶原纤维增加。然而，WECM和缬沙坦降低了膜剥离和胶原纤维。HFHSAD干预10周后，MetALD大鼠的BPs，包括SBP、DBP和MBP，显著增加。相对于对照大鼠，平均收缩压从110毫米汞柱增加到134毫米汞柱（图3B），而给予WECM 6周可显著降低MetALD大鼠的BPs（图3B-D）。这些发现表明WECM有效地降低了BP。

血脂异常和高血压与血管内皮功能密切相关；因此，我们测量了CRP、ET-1、Ang II和eNOS生化标志物，以评估血管内皮功能。从图3E-H中可以看出，与对照组相比，模型组的CRP、ET-1和Ang II含量显著增加。同时，eNOS水平下降，提示MetALD大鼠的血管内皮功能受损。缬沙坦和WECM-M给药6周可改善这些指标。

我们测定了血清氧化应激生物标志物以评估HFHSAD和WECM如何影响全身氧化应激。与对照组相比，模型组大鼠血清SOD显著降低，而血清MDA水平升高（图3I，J）。WECM可显著提高MetALD大鼠血清SOD含量，降低血清MDA含量。此外，我们还测量了大鼠肝脏中的氧化应激生物标志物。模型组大鼠肝脏SOD和GSH-Px水平较对照组明显下降。WECM显著增加了大鼠肝脏内SOD和GSH-Px的含量（图3K，L）。总之，WECM可以改善HFHSAD诱导的大鼠氧化应激。在WECM的三个剂量组中，WECM-M和WECM-H剂量均能有效改善肝脂肪变性、高脂血症、高血压和氧化损伤，WECM-M-显示出优越的整体疗效。

图3 WECM改善了MetALD大鼠的血管内皮功能，降低了BPs并改善了氧化应激。（A）大鼠胸主动脉Masson染色（×200）。（B）收缩压（SBP）。（C）舒张压（DBP）。（D）平均血压（MBP）。（E-H）血清CRP（E）、ET-1（F）、AngⅡ（G）、eNOS（H）、SOD（I）和MDA（J）水平（n=8）。大鼠肝组织SOD（K）和GSH-Px（L）水平（n=8）。数据代表平均值±标准差。与对照组比较，##p<0.01，#p<0.05。与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01（所有p值均通过Student t检验获得）。

4. WECM对MetALD大鼠肠道微生物群多样性和组成的影响

为了研究WECM如何影响MetALD大鼠的肠道微生物群，我们对粪便样本进行16S rDNA测序，以分析肠道微生物群的组成和丰度。稀疏曲线通常是平坦的，表明有足够的样本数量（图S1）。如图4A和4B所示，与对照组相比，WECMM组的Shannon和Simpson指数显著增加，但Chao1指数没有显著变化（图4C），表明施用WECM改变了α多样性。正如主坐标分析（PCoA）所揭示的，WECM可能会影响肠道微生物群的β多样性，因为模型组的肠道微生物群总体群落结构特征往往与对照组不同。相反，WECM组大鼠的微生物群结构往往与模型组不同（图4D）。

我们研究了肠道微生物相对丰度的总体变化。厚壁菌门和拟杆菌门是各组的优势菌（图4E）。WECM处理显著降低了厚壁菌门的相对丰度，它提高了拟杆菌门的相对丰度，从而显著恢复了厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比率的升高（图4E，右）。拟杆菌属、普雷沃氏菌属和厚壁菌属是三个丰富的菌属。与模型组相比，WECM-M给药显著提高了拟杆菌的相对丰度（图4F）。

图4 WECM调节大鼠肠道微生物群的多样性和组成。（A）Shannon指数。（B）Simpson指数。（C）Chao1指数。（D）主坐标分析（PCoA）图。（E）三组肠道微生物群的相对丰度（左图）；门水平上厚壁菌门/拟杆菌门比率（右图）。（F）属水平上肠道微生物群的相对丰度。数据以平均值±标准差表示。n=8。与对照组比较，##p<0.01。与模型组相比，*p＜0.05。

此外，我们以线性判别分析（LDA）得分>3作为特征筛选的标准，我们利用线性判别分析效应大小（LEfSe）分析来检测两组细菌群落的生物标志物。根据分类进化分枝图（图5A）和基于LDA值的物种分布直方图（图5B），我们发现在对照组和WECM-M组中，阿克曼菌属、Bacteroidales_RF16_group_unclassified和Rikenellaceae显著富集（图5C）。然而，在模型组中，梭菌、Faecalibaculum和Herminiimonas显著增加（图5D）。

图5 线性判别分析不同肠道微生物群的效应大小（LEfSe）分析。（A）LEfSe分类进化分枝图。（B）LEfSe评分的直方图和三组中显著改变的细菌的相对丰度。（C）在对照组和WECM-M组中显著富集的菌群。（D）模型组中显著富集的菌。数据表示为平均值±标准差（n=8）。与对照组比较，##p<0.01。与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01（所有p值均通过Student t检验获得）。

5. WECM影响MetALD大鼠的代谢产物和代谢途径

为了评估WECM如何影响大鼠的内源性代谢产物，我们对对照组、模型组和WECM-M组的大鼠血清进行了非靶向代谢组学分析。主成分分析图显示，模型组与对照组以及WECM-M组与模型组的代谢物图谱表现出良好的相互分离（图6A、B）。我们后来进行了OPLS-DA（图6C，D），证实了三组代谢物的显著差异。OPLSDA模型的置换检验证实了我们模型的有效性（图6E，F）。

火山图（图6G，H）显示了负离子模式下代谢物的总体分布，红点和蓝点分别代表具有显著上调和下调的代谢物。点号表示VIP值。使用基于MS/MS片段数据的自建质谱数据库，我们总共获得了217种代谢产物，包括有机酸和衍生物、脂质和类脂分子以及有机氧化合物（图6I）。我们对对照组、模型组和WECM-M组之间的差异表达代谢物（DEM）进一步筛选，Student t检验的阈值为p＜0.05，OPLS-DA模型的阈值为VIP＞1，在模型组与对照组以及WECM-M组与模型组中分别鉴定了46种和30种已知的DEM（表2）。在去除模型组和WECM-M组中具有相似趋势的代谢物后，WECM-M处理恢复了5种DEM。15dPGJ2是唯一一种在模型组中表达显著降低但在WECM-M处理后显著升高的代谢产物。相反，模型组中1,5-anhydrosorbitol、d-谷氨酰胺、白藜芦醇和L-苏氨酸升高，而WECM-M处理后则降低（表2）。模型组与对照组和WECM-M组与模型组中具有显著上调和下调的前15种代谢物如图6J和K所示。图S2显示了正离子模式下的代谢组学分析结果。

图6 对照组、模型组和WECM-M组血清代谢组学的多变量统计分析（负离子模式，n=8）。（A，B）对照组与模型组（A）和模型组与WECM-M组（B）的PCA评分图。（C，D）对照组与模型组（C）和模型组与WECM-M组（D）的OPLS-DA评分图。（E，F）对照组与模型组（E）和模型组与WECM-M组（F）的置换检验结果。（G，H）对照组与模型组（G）和模型组与WECM-M组（H）差异表达代谢物的火山图。（I）对照组、模型组和WECM-M组之间已鉴定差异代谢物的热图。（J，K）对照组与模型组（J）和模型组与WECM-M组（K）之间的匹配分析。

表2 差异表达的代谢物

此外，我们还进行了“京都基因和基因组百科全书（KEGG）”分析，以预测WECM-M处理中的相关代谢途径。这些基因主要富集在脂质代谢中，如不饱和脂肪酸的生物合成、花生四烯酸代谢和氨基酸代谢（图7A）。有趣的是，15d-PGJ2的DEM是花生四烯酸代谢的下游产物，也是PPARγ的内源性激动剂。

此外，我们还进行了Pearson相关分析，以检测不同肠道菌群与关键差异丰富代谢物的相关性（图7B）。Rikenellaceae_RC9_gut_group与15d-PGJ2呈正相关。Anaerofustis、Clostridium、Denitratsoma、Faecalibaculum、Hafnia−Obesumbacterium、草螺菌属、叶杆菌和假单胞菌属与15dPG_2呈负相关。差异代谢物1,5-anhydrosorbitol、d-谷氨酰胺、白藜芦醇和L-苏氨酸与大多数标志性肠道微生物密切相关。其中，Bacteroidales_RF16_group_unclassified和Rikenellaceae_RC9_gut_group与L-苏氨酸、d-谷氨酰胺和1,5- anhydrosorbitol呈负相关。

图7 不同肠道菌群和关键差异代谢产物之间的KEGG通路富集分析和Pearson相关性分析。（A）KEGG通路富集分析。（B）Pearson相关分析。正相关显示为橙色，而负相关显示为紫色。显著性表示为：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

6. WECM通过激活15dPPGJ2/PPARγ信号通路抑制MetALD大鼠系统炎症

基于代谢组学和16S rDNA的发现，我们想确认WECM是否通过15dPGJ2/PPARγ途径发挥其药理作用。如图8A所示，与对照组相比，WECM显著提高了15d-PGJ2血清水平，证实了代谢组学的发现。此外，我们还测量了生物合成酶15d-PGJ2的表达水平，包括COX-1、COX−2和PTGDS。因此，模型组的COX-1和COX-2水平升高，但WECM给药后降低（图8B，C）。相反，PTGDS的表达在WECM处理后增加（图8D）。

RT-PCR和蛋白质印迹显示，WECM处理上调了大鼠肝脏中PPARγ mRNA和蛋白质的表达（图8E，F），而降低了脂联素的蛋白质水平（图8G）。RT-PCR的引物设计如表1所示。此外，模型组的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的血清水平升高，而WECM-M和WECM-H组的血清水平强烈下降（图8H-J）。HFHSAD不影响TGF-β的表达，而与模型组相比，WECM-H显著增加TGF-β表达（图8K）。总之，WECM激活15d-PGJ2/PPARγ信号通路以抑制炎症。

图8 WECM激活15d-PGJ2/PPARαγ通路，抑制系统炎症。（A-D）使用ELISA试剂盒测量15d-PGJ2（A）、COX-1（B）、COX-2（C）和PTGDS（D）的血清水平（n=8）。（E）通过RT-PCR评估PPARγ的mRNA表达。（F，G）通过蛋白质印迹测定PPARγ（F）和脂联素（G）的蛋白质水平（n=3或4）。（H-K）血清TNF-α（H）、IL-6（I）、IL-1β（J）和TGF-β（K）水平（n=8）。数据表示平均值±标准差，与对照组比较，##p<0.01，#p<0.05。与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

表1 用于RT-PCR分析的引物

7. WECM通过改善脂质代谢预防肝脂肪变性

鉴于HFHSAD诱导异常脂质积聚并导致肝脏脂肪变性（图2），PPARα是脂质代谢的主要调节因子。因此，我们检测了PPARα的mRNA和蛋白水平。如图9A所示，与MetALD组相比，WECM-H处理显著增加了PPARα mRNA和蛋白质表达（图9A，D），表明PPARα的激活。相反，WECM大大降低了酒精诱导大鼠肝脏中脂质代谢基因CD36和FABP4的上调（图9B，C，E，F）。这些数据表明，MECM通过减少脂肪生成和促进脂解来改善脂质代谢。

图9 WECM上调PPARα，下调CD36和FABP4的表达。（A-C）通过RT-PCR评估PPARα（A）、CD36（B）和FABP4（C）的mRNA表达。（D-F）通过蛋白质印迹测定PPARα（D）、CD36（E）和FABP4（F）的蛋白质水平。数据代表平均值±标准差，n=3。与对照组比较，##p<0.01，#p<0.05。与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

MetALD在肝脏患者中非常普遍。然而，由于涉及复杂而多方面的致病机制，在临床实践中没有用于治疗该疾病的商业药物。因此，迫切需要探索治疗MetALD的新方法。这项工作创新性地证明，WECM有效减轻了MetALD大鼠的肝脏脂肪变性、氧化应激、炎症和代谢紊乱。此外，WECM改变了整体肠道微生物结构和血清代谢产物谱，促进15d-PGJ2的产生，从而激活PPARγ信号通路以抑制全身炎症。此外，WECM通过上调PPARα，下调CD36和FABP4的表达来改善MetALD大鼠的脂质积聚。

越来越多的人认为肠道微生物群PPARs轴有助于MetALD的发展和进展。微生物组分析表明，厚壁菌门和拟杆菌门代表肠道微生物群中的两个优势门。此外，F/B比值紊乱与肥胖、NAFLD等代谢综合征有关。在ALD的情况下，拟杆菌门的减少是肠道微生态失调的特征之一。尽管如此，在用慢性酒精处理的大鼠ALD模型中，厚壁菌门的丰度降低。如Grander等人所示，嗜黏蛋白阿克曼氏菌在酒精性肝炎患者中的相对丰度最低，其丰度与纤维化呈负相关。重要的是，WECM通过降低F/B比率和梭菌水平，同时提高阿克曼菌水平，显著缓解了肠道微生物群的扰动。这些发现支持WECM对MetALD的治疗效果与调节肠道微生物群密切相关，肠道微生物群与炎症和代谢紊乱有关。

正如过去20年的研究结果所揭示的那样，肠道微生物群会影响宿主的代谢。代谢产物，包括脂质和有机酸，在MetALD大鼠中发生了很大变化，但在WECM处理后显著改善。在本工作中，HFHSAD饮食破坏了花生四烯酸代谢途径，表现为催化花生四烯酸产生PGH2的COX-1和COX-2水平显著增加。然而，PTGDS的表达大大降低，导致15d-PGJ2的合成减少。15d-PGJ2是一种具有抗炎作用的环戊烯酮前列腺素。WECM通过增加PTGDS和15d-PGJ2的水平来逆转这些变化，并抑制促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的产生。Wang等报道花生四烯酸与拟杆菌呈正相关。我们的研究结果显示，MetALD大鼠拟杆菌丰度显著减少，并且与15d-PGJ2呈正相关。然而，肠道微生物群与花生四烯酸代谢之间的关系及其潜在机制需要进一步研究。

15d-PGJ2是PPARγ的内源性激动剂，其抗炎活性与PPARγ激活密切相关。因此，我们评估了WECM如何影响肝脏中PPARγ的表达。正如预期的那样，WECM显著上调了大鼠肝脏中的PPARγ，并有效抑制了MetALD大鼠的血清促炎因子（TNF-α、IL-1β和IL-6），这表明WECM激活了肝脏中的PPSRγ以发挥抗炎作用。此外，WECM降低了肝脏脂联素水平，这是PPARγ的一个重要靶点。PPARγ是脂肪生成的关键调节因子，主要在脂肪组织中表达。我们假设WECM降低脂联素也有助于WECM在激活肝脏PPARγ方面的直接作用，但未来的研究有必要验证这一观点。

PPARα调节肝脏中的脂质代谢，包括脂肪生成和脂肪酸氧化。其他研究表明，PPARα缺乏会加剧ALD，而PPARα/γ的激活可能会减少肝脏脂质积聚、炎症细胞因子的产生和氧化应激。与此一致，我们的研究结果表明，WECM通过激活PPARα来抑制肝脏质量增加，改善高脂血症，并防止肝脏脂肪变性。此外，WECM降低了大鼠肝脏中脂质代谢基因CD36和FABP4的水平。据报道，PPARα和PPARγ配体对CD36的抑制可增强肝脏脂肪酸β的氧化。FABP4，也被称为aP2，代表与脂肪酸信号传导和运输相关的脂肪因子。FABP4缺乏可减轻胰岛素抵抗和血脂异常。这些数据和我们的发现为WECM通过激活PPARα改善异常脂质代谢来对抗MetALD的治疗效果提供了证据。

简言之，WECM改变了肠道微生物群，可能通过影响花生四烯酸代谢来促进15d-PGJ2的释放。15d-PGJ2触发PPARγ抑制系统炎症。此外，WECM激活PPARα以减少MetALD大鼠肝脏中的脂质积聚。

结论

总之，这些发现首次证明WECM减轻了MetALD大鼠的肝脏脂肪变性，改善了氧化应激，并改善了肝功能。从机制上讲，WECM改善肠道微生物紊乱，从而促进15d-PGJ2的释放。后者激活PPARγ以抑制全身炎症。此外，WECM激活PPARα以改善MetALD相关的脂质代谢紊乱。这些发现表明WECM可能是治疗MetALD的潜在有效方法。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S094471132400432X

中药物质基础、成分鉴定及入血分析：