脑声常谈丨小鼠社交威胁-安全测试实验方法总结|动物|安全测试|实验|对照组|小鼠属|易感性|社交威胁|翻译|表型

一．模型概述

社交压力是精神障碍发展的主要原因。为了提高临床前研究的转化价值，社交压力体验及其对小鼠的行为影响应与人类相当。慢性社交挫败模型（CSD）利用一种涉及身体攻击和感官威胁的社交压力来诱发类似于人类情感障碍的精神功能障碍。本文要介绍的是基于CSD模型的社交威胁-安全测试（STST），是一种CSD后精细行为测定。压力后行为测定需要确定社交压力源如何以及在多大程度上影响了行为。为了加强 CSD 的社交心理成分，本方案应用了为期 10 天的 CSD 处理，其中每日物理攻击被标准化为三次10秒交互，然后是24小时的感觉阶段。CSD处理之后是STST。STST允许长期被社交挫败的雄性小鼠与2个新的雄性个体（社交目标）相互作用：一个来自CSD期间遇到的攻击品系的社交目标，另一个来自新品系。两者同时呈现在三室测试场的不同隔间中。该测试能够同时评估社交回避的发展，以衡量成功的厌恶条件学习和社交威胁-安全辨别能力，两者都用于在一组长期社交失败的雄性小鼠中识别压力易感和压力抗性个体。第一，对这两种品系均产生社交回避的发展反映了一种普遍的厌恶反应，因此也反映了压力易感性的测量。第二，社交回避的发展若表现出威胁-安全辨别，则反映了压力抗性的衡量标准。最后，缺乏对攻击压力的社交回避反映了厌恶条件学习受损。该方案旨在通过包括转化标准，特别是威胁-安全辨别和厌恶反应泛化，来完善目前使用的压力易感性/抗性小鼠模型，将一组长期被社交击败的动物分类为抗性和易感亚群，最终推进未来的转化方法。

二．模型基础

一种在研究中特别重要的社交压力是社交从属压力。小鼠和人类一样，也能够做出一套丰富的社交行为，使它们适合用于涉及社交压力的调查。在实验室环境中，当成年小鼠被群体饲养时，它们建立了一个涉及等级形成的社交结构。近年来，一种被称为雄性原住-入侵

者模型的特殊变体在文献中得到推广，将社交复杂性简化为两只小鼠：一只原住民和一只入侵者。测试动物，被称为入侵者，被放在饲养有一个体型更大的、更年长的小鼠的笼子里，该小鼠被称为原住民或攻击者。然后，原住民身体攻击入侵者作为一种对抗方式，建立一个社交等级，其中原住民占主导地位，入侵者是从属地位。当对抗是一次性事件时，将其归类为 “急性社交挫败模型”，而反复的对抗则持续好几天（通常是10天），被称为 “慢性社交挫败模型（CSD）”。在CSD模型中，攻击是间歇性的，通常被限制在5-10 min的时期，被称为物理攻击阶段。在此阶段之后，入侵者和原住民被关在同一个笼子里过夜，用网状墙隔成两半，允许除身体接触外的所有形式的互动。这种结构，被称为感觉阶段，通过持续出现的威胁而不是直接的物理对抗来诱发压力。2018年，van der Kooji及其同事引入了一种改进的慢性社交挫败处理，通过标准化和严格限制物理攻击阶段来关注模型中的“社交心理”成分。改进后的模型将身体攻击限制在3次有不同原住民的10秒攻击期内，15 min的攻击间隔为感觉阶段。在第三次身体攻击之后，感觉阶段持续一夜。这个周期连续重复10天。改进的处理方法提高了CSD的转化效度，因为入侵者的身体伤害被最小化，并减少了身体攻击不同持续时间的结果可变性。

近年来，CSD后行为分析经常评估社交能力如何以及在多大程度上受到影响，包括但不限于对攻击性、记忆和快感缺乏症的行为分析。社交性被定义为小鼠天生偏好进行社交互动，而不是在社交上避免同种动物。由于社交能力受到压力效应的影响，因此建立了仅评估社交回避发展的分析方法。压力诱发的社交回避具有翻译相关性，因为它代表了人类社交焦虑和抑郁的主要行为症状之一。与人类相似，并不是所有的小鼠在接受CSD处理后都会产生社交回避，这表明在压力反应中存在个体差异性。利用社交回避发展中的个体差异性将长期社交挫败的雄性小鼠分为两个亚组：压力易感（社交回避）和压力抗性（社交非回避）。研究说明条件学习参与了CSD诱导的社交回避。具体来说，CSD诱导的社交回避是对原住民品系的特征的厌恶条件反应，作为对非条件刺激（即居民的攻击）的条件刺激。此外，在社交回避亚群体中，一些人可以进行在厌恶原住民的品系和其他安全的新品系的特征之间辨别，而其他个体对这两种品系都表现出普遍的社交回避。

本文介绍改进的CSD后行为分析方法STST能够同时评估社交回避的发展，作为一种衡量正确的厌恶条件反应（成功的条件学习）和社交威胁-安全辨别能力，这两种能力都被用来在一组长期社交挫败的雄性小鼠中识别压力易感和压力抗性的个体。社交威胁-安全辨别与厌恶反应泛化的评估扩展了用于将长期社交挫败的单一动物组分为抗性和易感亚组的翻译标准。

三．实验程序

图1．时间轴示意图。到达设施后，将所有小鼠单独饲养7天，然后指定到处理组：CSD压力处理组或对照处理组。处理持续10天，之后动物单饲养1天。设置竞技场来进行STST（在动物被单独安置后1天后进行）。从6 min的习惯化阶段开始。习惯化阶段之后，再进行另外6 min的测试阶段。最后，把动物送回饲养笼

（一）．实验处理

1．实验动物：C57BL6/J雄性小鼠，7周大，到达实验室后，在温度和湿度控制的设施中饲养（温度：23°C；湿度：38% ），保持12小时的光/暗循环（开灯：8：00；关灯：20：00），可以自由获取食物和水。

2．慢性社交挫败（CSD）

（1）处理组

在1周的习惯化后，使用CD-1品系作为原住品系（resident's strain）进行连续10天的CSD处理[详细的方案，参考慢性社交挫败（DOI: 10.1038/nprot.2011.361）以及改良的慢性社交挫败处理方法（DOI: 10.1073/pnas.1804412115）]。
将C57BL6/J小鼠引入CD-1小鼠的笼中，计数10 s 内的物理攻击。重复三次，每一次都用一个不同的CD-1小鼠，每次之间设置15min的间隔。
在这些时间间隔期间，在C57BL6/J小鼠和CD-1小鼠之间放置一个网状壁，只允许感觉接触，不允许物理攻击。在第三次之后，将C57BL6/J小鼠放在CD-1小鼠的笼子里过夜，用一个网状壁将两者隔开。重复10天。注意：CD-1小鼠数量= C57BL6/J小鼠数量+1。如果处理组的C57BL6/J小鼠数量低于10只，那么仍然至少需要10只CD-1小鼠，以确保在10天的处理期间，每天在最后一个感觉阶段（持续一夜）使用一只新的CD-1小鼠。
仔细评估这10天内动物的身体健康状况。如果动物严重受伤，出于伦理和科学（处理后测试期间的活动）的原因，将其排除在实验之外。表1提供了一个健康检查表。

（2）对照组

与处理组相同年龄的小鼠，饲养环境也保持一致。
经过1周的习惯化后，将对照组动物引入一个空笼子中引入90秒，然后将它们送回单独的笼子（单只饲养），由与处理组相同的网状壁隔在笼子的一侧。每天与10个处理日并行进行。

注意：建议将对照组和处理组饲养在不同的房间。

3．在最后一个（第10个）感觉阶段之后，将所有的小鼠饲养在新的笼子里，饲养条件与到达实验室时描述的相似，并让它们休息过夜。

注意：最后一个感觉阶段应该持续24小时，然后动物进行单独饲养。

（二）．处理后测试：社交威胁-安全测试（图2）

1．在CSD处理后，将所有小鼠（处理组和对照组）饲养在新的笼子中，饲养条件与到达实验室时描述的相似，并让它们休息过夜。

2．在上午的工作时间（8:00-13:30），使用5%的乙醇清洁三箱测试场（长方形，总尺寸为60 cm x 40 cm，由透明的丙烯酸墙和光滑的地板制成)），并将其放置在37 lux的光照条件下的摄像机下。确保整个测试场都可见。

3．用5%乙醇清洁网状围栏（金属或丙烯酸制成的笼状），如图1A中的角落所示。

4．习惯阶段：将实验动物引入到测试场中心，允许其探索6 min，然后将它们送回笼子。

5．将新（未知）CD-1社交目标（同种）放置在一个网状围栏下，将新的129/Sv品系的社交目标放在另一个网状围栏下。

注意：重要的是要使用一个未知的129/Sv的同种小鼠，以避免熟悉度偏差。最好每个测试场有4个网格围栏：2个用于习惯化阶段，2个用于测试阶段。

6．测试阶段：立即在测试场的中心重新引入测试动物，并允许探索6 min。

7．结束后把所有的动物都送回饲养笼。在不同动物的测试之间，用5%的乙醇清洁测试场和网状围栏，但不要在观察同一动物期间清洁，也就是说，不要在习惯阶段和测试阶段之间清洁。

8．在动物之间交替选择网状围栏的位置（而不要在同一动物内部的两个阶段之间交换），以控制可能的位置偏爱偏倚。

（三）．评分与分析

注意：只有压力后处理试验，即对STST进行评分和分析（而不是对CSD应激处理的分析）。

1．将交互区域定义为网格围栏边界周围的2 cm。

2．当动物的鼻子在交互区域内时，对在习惯阶段探索网状围栏的时间进行评分。

3．在测试阶段，当动物的鼻子在互动区域内时，对与社交目标互动的时间进行评分。

注意：检测可以手动（使用计时器或软件进行手动评分）或自动实现。无论采用何种检测方法，都取鼻尖进行探索和社交互动测量，取身体的中心点进行与活动相关的测量（如移动距离）。

4．计算社交互动指数如下：在测试阶段探索每个社交目标所花费的时间 / 在习惯化阶段探索两个空网格围栏所花费的平均时间（图2B）。

5．将处理组分为3个亚组如下：动物对CD-1社交目标的社交互动指数≥1被称为非回避者，动物社交互动指数<1且对两个社交目标都回避被称为非辨别回避者，动物仅对129/Sv社交目标的社交互动指数≥1被称为辨别回避者（图2C-D）。

注意：三个亚组中每一个的动物数量在不同的动物批次之间可能有所不同（在接受CSD处理的所有动物中，约有1/3将显示三个亚组之一的表型特征）。

6．通过统计分析处理组和对照组之间的CD-1社交目标的社交互动指数（参数双样本t检验或非参数M．annWhitney检验）来评估压力效应。

图2．社交威胁-安全测试。(A)．测试设计。测试是在一个三室的场地中进行的，被分成三个相等的部分，由有开口的透明墙壁分开，允许测试动物（C57BL6/J，黑色）在中间移动。在每个外侧隔室中，都放置了一个网格围栏。其中一个围栏包含了一个新的社交目标，来自CSD处理期间遇到的原住品系（CD-1，白色）；另一个包含另一个新的社交目标，在年龄、大小和性别上与原住的新小鼠相匹配，但皮毛颜色不同（129/ Sv，棕色）。这两个社交目标都比测试的动物年龄更大、体型更大。测试动物被引入到测试场的中间，在习惯阶段，网格围栏是空的，在测试阶段，将社交目标放置在网格围栏内，两阶段均可以探索6 min。(B)．社交互动指数计算方法。(C)．慢性社交挫败压力效应：处理组将CD-1作为社交目标，且社交互动指数<1，作为对CD-1品系的社交回避发展的测量。与此同时，对照组完整的基线社交能力水平反映在具有相同社交目标但社交互动指数≥1。这导致两组间与CD-1社交目标的社交互动指数存在显著性差异。(D)．社交威胁-安全测试在CSD处理后的代表性结果。根据动物与社交目标的社交互动指数，将处理组分为三组。 (E)．STST测试阶段中每个亚/组的代表性热图。较深的颜色表示在该区域花费的时间更多

表1．慢性社交挫败程序的中止标准。该表共显示了四组观测，每组都有几个子观测。每个观察结果都有一个分数。根据分数的总和，提出了建议采取的措施。

观测

得分

1．体重

-稳定

-减少<5%

-减少5%-10%

-减少11%-20%

-减少>20%超过48小时

2．一般状态

-皮毛光滑、有光泽，体孔清洁，眼睛清澈、有光泽、呼吸正常，动物感觉正常温暖

-皮毛缺陷（缺乏或过度的身体护理），秃斑

-毛暗沉，紊乱，体孔不整洁，眼睛浑浊或闭上，肌肉张力增加

-毛脏，孔粘或潮湿，姿势异常，眼睛浑浊或闭上

-毛脏，孔粘或潮湿，姿势异常，眼睛浑浊或闭眼，持续> 48 h

-痉挛，麻痹（躯干肌肉，四肢），呼吸声（不规则呼吸），动物感觉冷

-动物感到寒冷，呼吸频率大大增加，腹呼吸，持续>10分钟

3．自发行为

-正常行为（睡眠，对吹气和触摸的反应，好奇心，社交互动）

-轻微偏离正常行为

-行为异常，运动技能受限，或运动过度

-自我隔离、嗜睡、明显的高活动或行为刻板印象、不协调

-抓握时反复发出痛苦的声音，自我攻击，自我切割

4．对应激处理的观测

-无明显咬伤

-愈合咬伤，无并发症

-咬伤（≤2），无出血，无“自发行为”类别评分

-咬伤（>2），无出血且未在“自发行为”类别中得分；或者一个正在出血的咬伤

-咬伤（>2）并出血

-严重的咬伤

评估和措施

总分

0 = 没有压力

1 = 低压力；继续仔细观察，直到第二天

1-8

2 = 中等压力；必要时进行简单的医疗护理（如止血、伤口涂抹药膏等）;每天评估两次病情

9-14

3 = 中等压力；通知兽医；每天检查两次；必要时采取适当行动（如液体替代、浸泡饲料、高热量食物、止痛剂）

15-20

4 = 高水平压力；立即停止实验；必须提交给兽医；按规则处死

或更高

四．预期结果

1．社交互动指数作为厌恶条件反应的测量指标

相比对空网格围栏的探索，社交互动指数≥1反映了与各自社交目标更大的社交互动。在基线条件下，这里定义为既没有喜爱和厌恶经验的特征的品系（这里的社交目标对照组和129/ Sv社交目标处理组），完整的社交水平反映在社交互动指数≥1。与此同时，在一个与一个特定的品系（这里是原住的品系，即CD-1品系）社交厌恶的条件反射经验（这里是CSD处理）中，由于其特征作为条件刺激，社交回避发展作为正确的厌恶条件反应的测量，反映在相同品系的社交互动指数<1中。CSD应激效应是第一个被评估的，并且在总体处理组水平上。具体来说，压力效应反映在与CD-1社交目标社交互动指数<1的的处理组中，作为对CD-1品系的社交回避发展的衡量标准。与此同时，对照组的完整基线社交能力水平反映在具有相同社交目标的社交互动指数≥1上。这导致两组之间与CD-1社交目标的社交互动指数存在显著差异（p<0.05）（图2C）。

2．通过社交威胁-安全测试，在一个长期社交失败的群体中识别出三个不同的表型亚组

根据动物的社交互动指数对其进行划分后，两个社交目标之间的单个亚组内的指数存在显著差异（p < 0.05），仅在辨别回避者亚组中观察到（图2D，E）。辨别回避者亚组和非辨别回避者亚组与CD-1社交目标的社交互动指数<1，这是对条件刺激（CD-1品系）的社交回避发展的测量，从而反映了正确的厌恶条件反应和成功的厌恶条件学习的发展。相比之下，非回避者亚组的社交互动指数（≥1）反映了具有相同社交目标（CD-1品系）的厌恶条件学习受损。同时，威胁-安全辨别能力反映在辨别回避者亚群体中，其对129/Sv社交目标的社交互动指数≥1，作为对安全/中性刺激（129/Sv品系）的完整社交水平的测量。相比之下，非辨别回避者亚组的厌恶反应泛化反映在对相同的社交目标的社交互动指数均<1，因此，对安全/中性刺激的表现为厌恶条件反应。每个亚组中小鼠的百分比约为33%；然而，这是不可预测的，因为一些批次的动物在每个亚组中或多或少都有。最后，没有社交优先偏差作为一个潜在的混杂因素，这反映对对照组内的两个社交目标的社交互动指数均≥1。

3．对社交威胁-安全测试结果的解释

本文讨论了辨别回避者亚组的特征，其包括成功的威胁相关线索的条件学习和威胁-安全辨别，作为压力抗性个体的特征。相比之下，创伤事件后的普遍厌恶条件反应，正如非辨别回避者亚组所看到的，是与压力相关的精神障碍的一个关键症状，如创伤后应激障碍和焦虑症，因此，是压力易感个体的特征。最后，非回避者亚组代表了学习受损的一种表型。

五．注意事项

1．不同的饲养条件可以改变攻击性的社交水平，并可能影响处理后测试（即STST）获得的结果。这些条件包括在所有动物到达后和处理后测试前24小时单独饲养，以及在10天处理期间单独饲养对照组。此外，如果对照组意外应激，CSD压力效应会受到影响。这可能是由于对照组在10天的处理期间暴露在处理组的压力引起的气味和声音中，以及对照组目睹了处理。因此，建议将对照组和处理组安置在不同的房间。

2．此外，由于条件学习的参与，某些步骤对于获得处理后测试结果是至关重要的。这包括对年轻成年小鼠进行为期10天的处理，以及在休息后24小时进行处理后测试。条件学习在年轻（或年长）的小鼠身上可能是不同的。同样地，进行超过或少于10天的处理分别意味着对动物进行或多或少的调节。处理时间的变化可能导致不同的亚组规模。

3．此外，建议在同一实验中，要么由同一实验者对所有动物进行处理和处理后测试，要么进行处理的实验者和进行处理后测试的实验者之间的区别对所有动物都是相似的。这是因为实验者代表了动物的整体条件反射（CSD处理）和测试（STST）环境的一部分。因此，同一实验中的所有动物在整个实验过程中都应该暴露在相同的环境中。

4．此外，动物在STST中的行为可能会被气味线索所混淆。动物之间用5%乙醇清洗使气味线索标准化。然而，避免在同一动物之间的STST的两个阶段（习惯阶段和测试阶段）之间进行清洗。这是因为习惯化阶段的部分目的是为了让动物熟悉这个测试场，因此在测试阶段，动物的行为主要是由新的社交目标的新存在所驱动的。因此，这两个阶段之间的清洁会影响动物在习惯阶段的气味线索，使场地在STST的测试阶段不那么熟悉。

5．此外，最好每个场地有四个网状围栏，其中两个用于习惯阶段（总是空的），两个用于测试阶段（总是与社交目标一起使用），以消除从测试阶段到习惯化阶段的CD-1和129/Sv社交目标的潜在残留气味。消除网内的残留气味是至关重要的，因为它会影响动物在习惯阶段对网状围栏的探索，改变社交互动指数结果，从而影响亚组划分。

6．同样，建议将STST中特定的社交目标在不使用时饲养在类似的条件下。这是因为若一个社交目标参与了其他处理或测试会在STST中影响网状围栏中各自目标的行为。例如，在其他实验中使用CD-1社交目标作为CSD处理的原住民，当STST中使用时，可以改变其相对于129/Sv的攻击性水平。在STST中，攻击性水平的差异可以向测试动物发出不同的信号，产生一种偏好偏差，这不是归因于处理10天后的条件学习。因此，在STST中使用之前有相似经验的两个社交目标可以帮助标准化两者在网状围栏中的行为和线索。

7．另一项避免优先偏见含义的措施包括使用比测试动物更年长、更大的社交目标，确认主要线索是品系的特征，而不是年龄或大小。为此，STST采用129/Sv品系对CD-1和C57BL6/J品系进行对比。129/Sv品系的皮毛颜色与两者都不同。测试不同皮毛颜色的不同品系，并了解处理后测试的结果是如何受到影响的，这将是很有意义的。、

六．模型的优缺点

1．这里的行为方案描述了社交威胁-安全测试，用于将CSD处理后的单个组分为三个不同的亚组，作为一种方法来调查压力易感性和抗性的潜在生物学机制，并测试潜在的处理方法。社交回避表型稳健、可靠、易于测试，具有行为学相关性和较强的表面效度。不像其他的社交互动测试，STST能够同时评估社交回避发展和社交威胁-安全辨别能力。STST的结果被用于识别一组长期社交失败的小鼠中的压力易感和压力抗性亚组，这与在人类中描述具有威胁-安全辨别的抗性个体和具有厌恶反应泛化的易感个体的证据一致。这种分类之后可以进行实验操作，以帮助解开压力抗性和易感性的神经基础，以及具体的威胁-安全辨别和厌恶反应泛化机制。通过关注不同个体对同一压力源反应的异质性，代表着着从单独开展疾病导向研究到同时开展疾病和健康导向研究的范式转变。这种范式的转变可能有助于开发新的预防措施和确定改进的靶向处理策略。

2．该模型的一个局限性是，只对雄性进行了研究。因为STST是基于CSD模型的，该模型是基于雄性小鼠在自然界中的行为而开发的，没有评估其与雌性小鼠的相容性。与雌性小鼠兼容的测试是遵循对两性或仅对雌性小鼠进行的压力处理，需要进一步的研究来将这些发现从雄性小鼠扩展到雌性小鼠。此外，这里报告的预期结果来自于年轻的成年小鼠。这将增加我们的理解，知道如何（如果）发现改变使用不同的年龄。值得注意的是，最近的一项研究发现，不同年龄组的小鼠在CSD后的社交回避行为是相似的。同样，其他需要考虑的变量是处理时间，如果不超过10天，以及如果在休息超过24小时后进行的行为试验的时间。总的来说，该模型极大地改进了目前使用的应激易感性/抗性小鼠模型，并有助于推进未来的翻译方法。

参考文献：

[1] AU - AYASH S, AU - MüLLER M, AU - SCHMITT U. Social Threat-Safety Test Uncovers Psychosocial Stress-Related Phenotypes [J]. JoVE, 2023, 202): e65640.

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