目前哺乳动物模型已被广泛应用于肝脏研究，但是没有一个单一的动物模型能够概括人类肝脏疾病的各个方面。结合多种动物模型更有可能产生互补的见解。而斑马鱼是发育生物学中最受欢迎的脊椎动物模式生物，在关于肝脏疾病的研究中也受到了广泛关注。考虑到哺乳动物模型的缺点，迫切需要高通量的动物模型，以应用于肝脏疾病药物的早期筛选。斑马鱼在这方面提供了一个很好的机会，因为它们拥有与人类相似的器官和组织，并且胚胎和幼鱼的体型较小，所以可将其用于进行高通量的药物筛选。目前发现70%的人类蛋白质编码基因与在斑马鱼中发现的基因有关，而82%的已知与人类疾病相关的基因与斑马鱼对应。此外，与哺乳动物不同的是，斑马鱼可以简单地浸泡在含化合物的水中，但也可以采用其他给药途径，包括注射和口服灌胃。最后，斑马鱼在基因层面上便于处理的，基因组编辑工具(CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物)以及使用反义寡核苷酸的基因敲除方法经常被用来成功地获得反映特定人类的定制模型。
通过构建不同的斑马鱼肝损伤模型，可以模拟酒精性脂肪肝，病毒性肝炎等疾病引起的人类肝脏损伤。目前引起肝脏损伤的因素主要有药物、病毒、高脂高胆固醇饮食和酒精等。
药物诱导的斑马鱼肝损伤模型
药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）是由于服用各类化学药物、中药制剂、膳食补充剂等所诱发的急性或慢性肝损伤。非甾体抗炎药对乙酰氨基酚是一种常用的镇痛和解热剂，在治疗剂量时是安全的。但过量使用时会引发有毒代谢物N-乙酰-苯醌亚胺(NAPQI)的过量产生，从而导致致命的肝细胞损伤和肝功能衰竭。小鼠是研究对乙酰氨基酚过量的首选动物，有报道称发现人类和小鼠两者在对乙酰氨基酚毒性剂量上相似。而且两者关于对乙酰氨基酚的毒性机制可能相同，包括线粒体损伤，氧化应激，谷胱甘肽（GSH）消耗等。但是目前在用较低浓度对乙酰氨基酚诱导小鼠，为了避免因为营养状况而引起的肝脏GSH水平的变化，一般会对小鼠进行禁食。而当使用剂量达到400～600mg·kg-1时，则不会采取禁食。然而禁食是否会导致模型的临床相关性降低还存在争议。而以胚胎阶段的斑马鱼为实验模型就可以规避这一问题。一般将受精后的斑马鱼胚胎暴露在对乙酰氨基酚时，斑马鱼通常还不能进食。一些研究人员就在对乙酰氨基酚建立斑马鱼肝损伤模型的药物筛选中，以靶点肿瘤坏死因子(TNF)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，NF-κB等为生物指标物对斑马鱼胚胎进行干预，发现富马酸二甲酯，连翘酯苷a，羟基红花黄色素等药物提取物对斑马鱼肝脏具有保护和治疗作用。另一种非甾体抗炎药丙戊酸作为一种肝脏发育抑制剂来研究肝脏发育以及肝脏损伤中也得到了运用。
病毒感染诱发的斑马鱼肝损伤模型
斑马鱼是研究感染和炎症的优秀的动物模型，正被越来越多地用于模拟人类病毒感染。研究指出在斑马鱼细胞上发现的许多病毒识别受体或借助实验操作可以使病毒识别受体与人类细胞上的病毒识别受体同源。例如用人肺上皮细胞A549异种移植的人源化斑马鱼模型来研究SARS-CoV-2病毒感染。也有用酶联免疫吸附测定法将肝炎病毒的拟病毒肽偶联在酶上，再将其注射到斑马鱼胚胎中来研究。而选用斑马鱼来研究人类病毒既可以在一定程度反应病毒在人体内的过程，又因为物种之间的差异，可以降低病毒泄露感染的风险。这就比在哺乳动物上筛选要安全的多。丙型肝炎病毒(HCV)是一种单链阳性RNA病毒，属于黄病毒科。除了引起肝炎或肝脏炎症外，持续的HCV感染还可导致肝细胞癌。通过将自主复制的亚基因组复制子导入斑马鱼模型中可以研究体外HCV感染。有研究建立了肝脏特异性HCV亚复制子模型，检测出HCV感染引起的基因表达变化，证实了人类自噬相关蛋白ATG10的两种亚型对斑马鱼HCV亚基因组复制子的相反作用。此外，还有研究将表达病毒的活性成分的基因移植到斑马鱼模型进行实验。3C蛋白酶是人甲型肝炎病毒诱导的病理反应的关键因素，对细胞靶点具有全面的作用。有研究将含有3C蛋白酶的质粒导入到斑马鱼胚胎中研究人甲型肝炎病毒对肝细胞感染过程。
重金属诱导的斑马鱼肝损伤模型
从人类进入到工业化以来，重金属(HMs)造成的水污染一直是人类关注的一大问题。急性重金属中毒或是重金属在人体的缓慢积累都是造成人体肝脏损伤的一大原因。而锑和镉常在斑马鱼模型中被用来模拟人体重金属中毒。以斑马鱼模型来模拟重金属中毒与哺乳动物模型相比有两大优势：一方面斑马鱼生长快，繁殖周期短，这对了解重金属积累后的亲本对其生物体后代的影响很有帮助。有研究将性成熟的斑马鱼暴露于不同浓度的氯化镉（0.01、0.1和1μmol·L-1）中，研究氯化镉的生殖毒性及其后代甲状腺激素系统的功能发育。实验结果显示亲代斑马鱼暴露于1μmol·L-1的氯化镉下，会产生不同程度的畸形后代。在胚胎受精后5dpf和10dpf测定发现，斑马鱼中3，5，3′-三碘腺苷和甲状腺素的水平都有明显下降。最终证明亲代接触氯化镉对斑马鱼产生生殖毒性，其影响可从亲代转移给后代，导致甲状腺内分泌系统的发育毒性。
另一方面由于斑马鱼胚胎的透明性，这就有利于研究重金属中毒对生物发育和组织损伤。为了研究锑对斑马鱼胚胎的神经毒性，实验将斑马鱼胚胎暴露在锑（0、200、400、600和800mg·L-1）后，斑马鱼胚胎表现出异常的表型，如体长缩短、形态畸形和心脏功能减弱。行为学实验表明，锑对斑马鱼胚胎的神经毒性，表现为自发运动频率降低，对触摸的反应延迟，运动距离减少。锑还会导致斑马鱼胚胎中乙酰胆碱酯酶（AChE）和神经功能标志物如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、巢蛋白、髓鞘碱性蛋白（MBP）等水平下降，此外，还发现锑显著提高了活性氧水平，并显著降低了GSH和SOD的活性。还有研究使用绿色荧光蛋白标记过的斑马鱼转基因株，在其胚胎受精72h后孵育2h，然后将其暴露在不同浓度硫酸铜中。通过中性粒细胞迁移、炎症细胞因子和转氨酶分析、氧化标记物以及肝脏的组织学变化来评估斑马鱼肝脏受损程度。对于金属镉，有研究就将斑马鱼暴露于0（1组）、2.5（2组）和5µg·L-1（3组）镉（Cd）10周，每组分别保持26℃和32℃的无镉水7d。采用26个指标比较雌性斑马鱼肝脏中26℃和32℃的差异，其中包括5个生化指标（Cu/Zn-SOD、CAT和iNOS活性；LPO；MT蛋白）、8个氧化应激分子指标（Nrf2、Cu/Zn-SOD、CAT、HSF1、HSF2、HSF2、HSP70、MTF-1和MT的mRNA水平），5个炎症分子指标（IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS和NF-κB）、8个金属离子转运指标（ZnT1、ZnT5、ZIP8、ZIP10、ATP7A、ATP7B和CTR1的mRNA水平）。发现重金属污染的程度呈一定的热相关性，温度越高斑马鱼肝脏的各项指标结果就越偏离正常值。
肝脏机械损伤引起的斑马鱼肝损伤模型
肝脏具有快速和丰富的再生能力，即使近2/3的肝脏通过手术切除，剩余的肝脏也能迅速恢复原来的大小。在啮齿动物中，70%肝切除术或30%部分肝移植后的剩余肝脏在术后7～10d恢复到100%。而在人类身上对于肝肿块在手术后的3个月左右能完成恢复。但在对病人进行肝切除后，往往充满了相对较高的术后并发症的发生率，比如肝衰竭，缺血-再灌注损伤等。随着大多数高容量的复杂危重症护理的出现，与肝切除术相关的死亡率已下降到不到5%。但依旧需要寻找更好的术后治疗方案，以提高患者的生存率和后续的生存质量。而以斑马鱼为模型研究部分肝切除术和术后的恢复治疗对病人的健康具有重要价值。斑马鱼的肝脏结构与哺乳动物不同，它由3个叶组成，包括两个背叶和一个沿肠扁平的腹叶。但由于两者细胞表型高度相似，斑马鱼肝脏也能发挥哺乳动物的肝脏功能。而又由于斑马鱼身体的部分透明性，可以肉眼操作和观测斑马鱼的肝脏和切除，而使用哺乳动物不仅操作复杂，而且对于肝脏再生的情况必须对动物进行安乐死后才能观察。所以用斑马鱼来部分替代这些模型是很有必要的。有研究采用部分肝切除术在斑马鱼身上通过切除整个腹侧叶来构建斑马鱼肝损伤模型。通过挤压心脏后方的皮肤可以在麻醉后的斑马鱼身上开一个切口而不损害任何内部器官。这样可以打开一个3～4mm大小的切口。通过切口可以直接切除肝脏，并评估切除的程度。在非人为干预的条件下，斑马鱼自身可以将伤口恢复并最终愈合，且没有任何初级伤口闭合。实验以此研究了斑马鱼的肝脏具有异形性再生的能力。发现切除腹叶导致背叶的代偿性再生，而不是缺失的腹叶的再生，并最终在8周内恢复肝脏肿块。也有研究将这种肝损伤模型引入到对肝窦内皮细胞(LSEC)中来模拟研究人体肝再生的机制，发现LSEC对于肝细胞的增殖和维持小叶的有组织的结构是必要的。LSEC通过与来自环境的信息相互作用并整合一系列信息来调控肝切除后出现组织坏死和小叶结构紊乱，使再生的肝细胞有一个有组织的血管网络来进行排列恢复人体的肝功能。
酒精诱导的斑马鱼急性肝损伤模型
长期的过度饮酒有可能会对200多种疾病的出现和伤害结果产生影响。过度饮酒产生的治安，医疗等问题在大多数社会中具有重大的社会经济负担。其中酒精性肝病(ALD)是最引人关注的疾病包括单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎、肝硬化和终末期肝细胞癌(HCC)。而目前的大多数动物模型并不能概括人类ALD的全疾病谱。因为与ALD临床相关的模型应引起一定的特征，包括：严重的脂肪变性、肝细胞损伤和肝浸润。一个独立的动物模型很难满足这些条件。目前酒精引起的肝损伤模型以哺乳动物为主，而不借助灌胃等手段，让动物正常摄入酒精，一般会采用酒精液体饲料进行喂养，但这种手段诱导后的变化主要是肝脂肪变性。而肝损伤后续的肝纤维化或肝硬化只有再对肝脏进行继发性损伤时才会出现。
斑马鱼胚胎暴露在2%酒精环境下，仅24h就能表现出肝脂肪变性和纤维化。这就使得人们可以用斑马鱼幼体来研究急性酒精摄入造成的肝损伤。将受精96h后的斑马鱼胚胎暴露在2%酒精环境下24h发现。在处理8h后斑马鱼幼体开始出现肝脂肪变性，随着时间推移发生脂肪变性的幼体比例持续上升。此外，有文献报道用0.5%酒精持续诱导斑马鱼2～4周，足以诱发其从脂肪变性到包括纤维化在内的一系列酒精性肝病症状。有研究评估了成年斑马鱼作为体内模型在酒精诱导的急性肝损伤中快速评估药物疗效的效用。以丙氨酸氨基转移酶（ALT），炎症和新生脂肪生成相关的基因的mRNA为指标评估了烟酰胺核糖（NR）的保护作用。研究结果在其他哺乳动物模型中得到了验证。
膳食诱导的斑马鱼肝损伤模型
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种临床诊断，包括在没有次要的肝脂肪堆积原因的情况下，通过肝脏成像或活检确定存在5%或以上的肝脂肪变性。NAFLD跨越了单纯脂肪变性或非酒精性脂肪肝(NAFL)到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），在组织学上定义为肝脂肪变性、肝炎症和肝细胞球囊化伴或不伴纤维化。NASH可进展为肝硬化和肝细胞癌。而斑马鱼具有传统的脊椎动物身体结构，包括中枢和自主神经系统、消化器官和脂肪组织，且体外受精、发育迅速、光学透明性、易进行基因编辑等优点在构建非酒精性脂肪肝上受到人们的关注。有研究通过给斑马鱼喂食富含棕榈酸（PA）的食物发现，PA喂养组的体重比接受普通饮食的对照组增加30%。PA喂养后，血糖、血浆TG和TC水平均显著升高，分别比对照组高1.6倍、1.5倍和1.3倍。证明慢性富含PA的饮食可以诱导成年斑马鱼的肥胖、高甘油三酯血症和高血糖表型。此外，实验检测了斑马鱼肝脏中线粒体生物发生和功能中基因相对表达情况和细胞的ROS水平。发现上述这些检测因子都有显著变化，证明在PA喂养的斑马鱼肝脏中与肝损伤相关的两种主要应激信号通路（氧化应激和内质网应激）都高度表达，也证明实验建立了一种用饮食来模拟肝损伤的模型。而也有研究发现采用高胆固醇和高脂肪酸来喂养，比单一喂养效果更佳，其肝损伤指标更加明显。
此外，常用的小鼠等啮齿动物模型中缺乏人类胆固醇酯转移蛋白（CETP）同源物，使得这些模型中关于动脉粥样硬化的研究与人类存在差异。而斑马鱼则携带着CETP基因的同源基因，这使得斑马鱼的脂蛋白在种类和组成上类似与人类脂蛋白相似。所以用斑马鱼为模型来研究动脉粥样硬化更有可靠性。有研究就对斑马鱼喂食高胆固醇饮食来诱导动脉粥样硬化，并测量斑马鱼的胆固醇水平，HADHA和HADHB基因水平。最后，利用EGPF荧光成像和尼罗红染色法发现鱼油的动脉粥样硬化保护作用。此外，也有研究通过观察斑马鱼血管周围的巨噬细胞募集，炎症反应等指标发现双酚S（BPS）会诱发斑马鱼动脉粥样硬化。
参考文献：
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4、Bisphenol S exposure accelerates the progression of atherosclerosis in zebrafish embryo-larvae[J]. Wang Weiwei;Zhang Jie;Li Ze;Gu Jie;Qin Jingyu;Li Jiali;Zhang Xiaona;Ru Shaoguo.Journal of Hazardous Materials,2022
5、The zebrafish model system for dyslipidemia and atherosclerosis research: Focus on environmental/exposome factors and genetic mechanisms[J]. Vasyutina Marina;Alieva Asiiat;Reutova Olga;Bakaleiko Victoria;Murashova Lada;Dyachuk Vyacheslav;Catapano Alberico L.;Baragetti Andrea;Magni Paolo.Metabolism,2022
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