百萤课堂之APC与抗体的缀合实验方案

注1:整个缀合过程可以在 一天内完成。但是，缀合前对APC 的纯化可能需要24-48小时。除了下面列出的材料外，您还需要浓度至少为2mg/ml的抗体溶液。请您在进行APC抗体缀合实验之前熟悉如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。

注 2 : SMCC-APC缀合物非常稳定(在“交换缓冲液”中，在4℃下至少可以稳定几个月)。因此， 如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10毫克或更多的 APC,并将其用于几次抗体实验(在几周内)。SMCC-APC的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物。

一 .APC的制备

1. 将APC纯化。缀合前的浓度通常为 5-10mg/ml。

注意：APC在缀合前作为SAS(硫酸铵钠)沉淀物最稳定。如果将APC 以SAS沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。在用每毫升1升的“透析缓冲液”透析之前，用每毫升1升APC 的PBS进行透析2 次。

2.使用1.7毫克APC 修饰每毫克lgG, 包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。

3.检查APC的纯度和浓度，请测量280、620和655nm 处的吸光度。(1 mg/ml的APC 在 655nm处的OD为 5.9 ) 。 655/620比率>1.4 表明杂质被充分去除；655/280比率>4表明所有其他蛋白质均已充分去除。

二.APC的活化

1.使用前在无水DMSO中制备10mg/ml的SMCC 储备溶液。

2.每毫克APC加入6μlSMCC,并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60 分钟。

3.将纯化的 APC 过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少SMCC 相对于APC 的量，可能会有所好转。

三.1gG 还原

1.在蒸馏水中制备1M DTT(15.4 mg/100 μl) 的新鲜溶液。

2.1gG溶液浓度应为 4 mg/ml或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；MES 、磷酸盐和 TRIS 缓冲液(pH 范围为6至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于2mg/ml，则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加

10%。

3.用DTT配制20mMlgG溶液：每毫升 IgG溶液加入20μlDTT 原液并搅拌。室温下静置30分钟，无需额外搅拌 (以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸)。

4.将还原的lgG 通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分lgG 的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT 浓度可能会有所帮助。

四 .进行缀合

1.每毫克IgG 添加1.5毫克SMCC-APC 。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60 分钟。注意：这些摩尔比( 每 1gG 约2个APC)效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。

2.60分钟后，必须去掉 lgG 上未反应的游离巯基。

3.在 1.0 ml干DMSO中制备10 mgNEM的新鲜溶液。

4.每毫克|gG 添加 34μ g(3.4μl) 。室温下包裹并旋转20 分钟。