L-WRN培养基在胃肠道干细胞研究中的应用|培养基|活性|祖细胞|细胞系

类器官（Organoids）是一种由多能干细胞或成人组织干细胞衍生的三维结构，能够在体外模拟人体器官的特定功能和结构。这些培养物包括有丝分裂的干细胞和祖细胞以及体内组织中正常存在的后分裂分化细胞类型。类器官培养方法迅速在科学界得到认可，被广泛用于研究胃肠道生理学和病理生理学。为了从成人组织干细胞中培养类器官，培养条件必须包含干细胞微环境的组成成分，例如Wnt3a、R spondin1/2/3和Noggin等蛋白质因子。这些因子可以作为重组蛋白质直接添加，也可以通过由工程化细胞系分泌的条件培养基（CM）进行提供。
近年来，科学界对实验科学中的透明度、严格性和可重复性越来越重视。美国国立卫生研究院（NIH）及主要科学期刊编辑委员会都在呼吁加强实验可重复性和验证程序。这些呼吁部分是因为细胞系交叉污染和关键生物试剂验证不严，导致错误的实验结果、时间和资源浪费以及公众对科学信任的下降。相关行动措施之一是将严格的程序纳入以验证和鉴定可能在单一实验室或实验室之间随时间变化的试剂。
华盛顿大学医学院通过评估不同实验室生产的多个批次L-WRN CM的活性水平，探讨其批次间的一致性和可重复性，并为L-WRN CM的质量控制提供了指导方针。研究结果以题为L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams发表在Stem cell research期刊。
研究的重点是L-WRN条件培养基（L-WRN CM），这是一种由工程化L细胞系分泌的条件培养基，含有Wnt3a、R spondin3和Noggin。这种培养基广泛用于培养包括小鼠和人类在内的多种哺乳动物的胃肠上皮干细胞。为了确保实验的可靠性和可重复性，L-WRN CM的质量控制程序显得尤为重要。

图示描述：
1) L-WRN细胞系的种属验证、支原体污染检测以及细胞形态学特征。A图展示了通过PCR进行的物种验证结果，显示L-WRN细胞为纯小鼠来源。B图展示了支原体检测的结果，表明L-WRN细胞无支原体污染。C图通过显微镜观察展示了L-WRN细胞在解冻后不同时间点的形态变化，证实了其成纤维细胞特征。

2) L-WRN CM在不同储存时间和额外冻融循环后的活性。通过检测小鼠结肠球体的生长和增殖，发现储存时间和额外冻融对培养基活性的影响较小，但储存3周的培养基表现出活性略微下降的迹象。

3) 14个不同实验室生产的L-WRN CM批次对小鼠和人类结肠球体生长的影响。结果显示，除了一个已知技术错误的批次外，其余批次的培养基支持的球体生长非常一致，证实了L-WRN CM在不同实验室之间的高可重复性。

4) 这组图片通过CellTiter-Glo和LDH测定进一步量化了不同L-WRN CM批次对球体生长的支持。结果表明，除了技术错误批次外，其余批次的培养基支持的球体生长高度一致，进一步验证了其可重复性。

5) 通过qPCR分析了不同L-WRN CM批次对干细胞和祖细胞标记基因表达的支持。结果显示，除技术错误批次外，其余批次的培养基在维持干细胞和增殖细胞标记基因表达方面表现一致。

6) 不同L-WRN CM批次对Cdc25A-luciferase小鼠结肠球体增殖的影响。结果显示，所有正确生产的L-WRN CM批次在支持球体增殖方面表现出高度一致性。

7) 通过HEK293 Wnt报告细胞系评估了L-WRN CM的Wnt活性。结果表明，不同批次的L-WRN CM在诱导Wnt报告基因活性方面表现一致，支持其作为质量控制的一个方法。

全文总结：
本研究通过多种实验方法验证了L-WRN条件培养基在多个实验室之间的高可重复性。这为胃肠上皮干细胞培养提供了可靠的技术支持，确保了实验结果的可靠性和可重复性。研究还提出了一套详细的L-WRN CM质量控制程序，推荐使用定量分析方法如CellTiter-Glo和qPCR，以确保每批培养基的高质量和一致性。

参考文献：
VanDussen KL, Sonnek NM, Stappenbeck TS. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Res. 2019 May;37:101430. doi: 10.1016/j.scr.2019.101430. Epub 2019 Mar 27. PMID: 30933720; PMCID: PMC6579736.