蛋白质与小分子相互作用的调节是近年药物发现中发展最快的领域之一。在这篇综述中，讨论了过去十年（2014-2023）的进展，重点是分子胶（MG）——通过稳定天然蛋白相互作用或诱导蛋白新形态相互作用来诱导接近的单价小分子。分子胶进一步可分为三大类：降解型分子胶、非降解性 分子胶 或 蛋白互作稳定剂，以及诱导自缔合(induce self-association)的分子胶。这里继续介绍非降解性分子胶 和 蛋白互作稳定剂的分子机制。

降解型分子胶参考前期文章:

【Cell Chemical Biology】降解型分子胶分子机制总结

1. 天然类非降解分子胶

几类天然产物可以稳定蛋白互作（PPI），而不会导致任一蛋白质的降解。其中包括经过充分研究的雷帕霉素和大环内酯类药物，例如FK506和环孢素A(Cyclosporin A)。在这三种情况下，分子胶的作用机制都是回顾性发现的。环孢素是一种免疫抑制剂，可与亲环蛋白(Cyclophilin)和钙调神经磷酸酶（Calcineuin, 一种Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白磷酸酶）结合。三元复合物形成后，钙调神经磷酸酶的磷酸酶活性受到抑制，导致IL-2的激活。钙调磷酸酶也是大环内酯类药物的靶标，例如FK506（也称为他克莫司），它同时与FK506结合蛋白12 (FKBP12)和钙调磷酸酶结合。形成的三元复合物降低了FKBP12的肽基-脯氨酰顺反异构酶的活性和钙调神经磷酸酶的磷酸酶活性。雷帕霉素是一种有效的免疫抑制剂，可同时结合两种蛋白质：FK506结合蛋白(FKBP12)和FKBP-雷帕霉素相关蛋白(FRAP)，也称为mTOR。1995年的FK506/FKBP12/钙调磷酸酶和1996年的雷帕霉素/FKBP12/FRAP的晶体结构是分子胶三元配合物的第一个报告。在这两种情况下，天然产物与两种蛋白质伙伴形成广泛的配体-蛋白质相互作用，并占总埋藏表面积的25%–50%。

2. 人工合成类蛋白互作稳定剂

1. 14-3-3的 蛋白互作稳定剂

另一类重要的非降解天然产物分子胶是fusicoccanes。Fusicoccin-A (FC-A)和cotylenin-A可稳定支架、接头蛋白14-3-3及其下游靶标之间的天然PPI。14-3-3蛋白具有非常广泛的相互作用组，包括肿瘤启动子、肿瘤抑制子和转录因子。14-3-3通过识别并结合下游蛋白本质上无序的结构域/区域上的短磷酸丝氨酸/苏氨酸(pS/pT)基序来发挥其功能。14-3-3与其下游靶标的结合会产生不同的生物效应，具体取决于下游靶标的定位、功能和角色。对于转录因子，如ChREBP和雌激素受体α（ERα），与14-3-3结合具有抑制作用，控制它们在细胞核和细胞质之间的穿梭。通过FC-A调节14-3-3和ERα之间的天然相互作用，可抑制ERα与DNA的结合，并减少ERα依赖性细胞系的细胞生长。因此，14-3-3/ERα稳定剂可能是乳腺癌治疗的替代治疗策略，其中突变经常发生在ERα的配体结合域中。14-3-3也是MAP激酶信号通路的中央调节因子，具有双重作用。作为二聚体蛋白，14-3-3将RAF激酶维持在通过与两个RAF磷酸化位点（C-RAF上的pS259和pS621）相互作用而达到抑制状态。当通路激活、与RAS相互作用以及抑制性pS259位点去磷酸化时，会发生构象变化，使两个RAF激酶结构域与一个14-3-3二聚体结合形成二聚体。 活化RAF同二聚体或异二聚体促进MAP激酶信号传导。因此，14-3-3/RAF抑制复合物的稳定化提供了另一种调节MAPK途径的方法，而不是直接抑制RAF，该途径通常在癌症和某些发育障碍中失调。

尽管14-3-3的多个靶点的基本生物学原理已被充分了解，并且治疗干预的潜在优势也很诱人，但天然产物稳定剂的复杂性质使其不适合进一步的临床进展。此后，已经公开了多种方法来鉴定下游靶标特异性的14-3-3稳定剂，包括虚拟筛选、高通量筛选、和基于片段的筛选方法。在每种情况下，筛选都利用源自下游蛋白的磷酸肽，因为下游蛋白的无序结构域通常很难重组分离。在这里，更详细地描述了一些代表性示例（下图）。尽管14-3-3稳定剂的临床前研究并不像之前描述的一些分子胶那样先进，但这些研究的重点是这是一个系统的分子胶发现和优化模型；这种理性设计的、以结构为导向的方法可能会更广泛地揭示分子胶发现的基本原理。

使用有针对性的虚拟筛选方法来鉴定14-3-3/碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)复合物的稳定剂。ChREBP是一种葡萄糖响应转录因子，在糖脂毒性的发病机制中发挥重要作用。14-3-3与ChREBP结合导致其细胞质滞留并抑制其转录活性。因此，这种相互作用的稳定可能对2型糖尿病有治疗作用。ChREBP是少数不依赖磷酸化的14-3-3结合蛋白之一，以独特的α螺旋构象与14-3-3结合。复合PPI界面中的pS/pT位点可以容纳游离的硫酸盐、磷酸盐或单磷酸腺苷。通常抑制14-3-3/ChREBP PPI的膦酸酯类似物的筛选导致鉴定出一种PPI稳定剂，并进一步合理优化。优化后的化合物3在荧光各向性滴定中使14-3-3/ChREBP复合物稳定了14倍。三元晶体结构表明，该膦酸酯分子胶协同结合在14-3-3 磷酸化口袋中，并与14-3-3β和ChREBP肽形成多重相互作用（下图）。与14-3-3β (Lys51、Arg58、Arg129、Tyr130)和ChREBP (Arg128)形成极性相互作用。在化合物3、14-3-3 (Leu218、Ile219、Leu174、Leu222)和ChREBP (Ile120)的苯环之间也观察到疏水相互作用。化合物3的膦酸基团与Arg128（ChREBP）形成极性相互作用，进一步与Glu182（14-3-3）相互作用，从而锁定了该ChREBP残基的构象。 稳定剂的进一步优化使得它们能够在细胞环境中进行评估，结果显示ChREBP保留在细胞质中并抑制ChREBP转录活性。

基于束缚片段筛选(tethered fragment screen)发现14-3-3/下游客户蛋白稳定性的影响。片段由于尺寸小，为靶向PPI界面典型的复杂蛋白质表面提供了有用的起点。14-3-3上的肽结合沟在很大程度上是保守的，但客户蛋白磷酸肽的序列和构象因客户蛋白而异。因此，形成的14-3-3/客户蛋白复合物中FC-A结合位点的形状和氨基酸组成高度不同，允许选择性靶向14-3-3/客户蛋白PPI。此外，14-3-3上的不同残基可以作为“锚定”结合元件。例如，已经报道了针对14-3-3/p65和14-3-3/PIN1复合物的基于亚胺的束缚方法。与结合槽中部14-3-3的保守Lys122结合的p65肽含醛基片段通过采用促进相互作用的构象，显示出14-3-3/p65复合物的弱稳定性。以类似的方式，优化的含醛化合物（例如化合物23）通过与PIN1肽的色氨酸（磷酸位点的+1位）的特定pi-pi相互作用稳定了14-3-3/PIN1复合物（下图）。

14-3-3/磷酸肽复合物易于结晶，促进了基于结构优化的束缚片段方法。晶体学筛选鉴定出脒片段通过锚定离子键与界面边缘的14-3-3的Glu14结合。这些片段在每种情况下都以不同的结合模式稳定14-3-3/TAZ或14-3-3/p53复合物。使用完整质谱（二硫键束缚）鉴定了针对14-3-3上Asn42Cys突变的工程半胱氨酸的第二个片段。二硫键束缚技术依赖于片段与天然或工程半胱氨酸之间可逆二硫键的形成。1,600个二硫键片段的束缚筛选鉴定出在ERα衍生磷酸肽存在的情况下优先结合的化合物。共结晶证明了该束缚片段与先前确定的脒相邻的有利位置，从而能够采用片段连接方法来开发非共价14-3-3/ERα稳定剂。优化后的化合物24在荧光各向异性滴定中使14-3-3γ/ERα复合物稳定了25倍。结合模式和界面上相互作用的氨基酸残基如下图所示。

二硫键束缚筛选还针对下游磷酸肽客户蛋白(ERRγ )上的半胱氨酸残基以及在结合槽外围的14-3-3σ中发现的天然Cys38。在后一种情况下，使用具有不同形状和结合模式（ERα、C-RAF、FOXO1、USP8、SOS1）的14-3-3结合磷酸肽进行比较二硫键束缚筛选，鉴定出非选择性和客户蛋白选择性二硫化物稳定剂。C-RAF选择性片段（片段7）的结合模式如下图所示。值得注意的是，14-3-3/客户蛋白的多样性导致了命中化合物的多样性，适合进一步的结构优化。

发现非选择性片段（片段1）可以稳定14-3-3σ/ERα和14-3-3σ/CRAF复合物，并且对C-RAF具有更强的偏好。片段1被用作通过结构引导优化开发14-3-3σ/ERα复合物的不可逆共价稳定剂的起点。虽然两种情况下片段的结合模式相似，但两种客户磷酸肽却截然不同。ERα通过ERα C末端的Val595与14-3-3结合，而C-RAF与以磷酸-Ser259为中心的内部序列结合。片段的化学修饰包括用不可逆亲电子试剂替换二硫键、靠近14-3-3/ERα界面的修饰，旨在与两者发生特定相互作用，以及弹头在界面边缘的构象锁定与螺环。整体优化调整了对ERα的选择性，并且由于空间位阻，观察到对C-RAF的影响最小。化合物181在生物物理测定中显示出强烈增强的效力和协同性，类似于FC-A天然产物（14-3-3/ERα肽复合物的appKd为18 nM，在100μM化合物中）。在晶体结构中，181与Cys38（14-3-3）共价结合，并在界面边缘与Arg41（14-3-3）和Asp215（14-3-3）形成水介导的氢键（下图）。在蛋白质/肽界面，对氯苯胺部分与Lys122 (14-3-3)形成卤素。四氢吡喃的氧、ERα的末端羧基和苯胺的NH基团之间形成水网络。 在甲基和由14-3-3残基（Leu218、Ile219、Leu222）形成的浅疏水袋之间观察到疏水相互作用。螺环的存在锁定了复合物的整体构象，导致结合口袋的高度形状互补性，并且比更灵活的类似物显著提高了协同性。在基于细胞的ERα荧光素酶报告基因检测中，与天然产物相比，化合物181更有效地降低ERα转录活性，并阻止乳腺癌细胞增殖。在蛋白质印迹中，化合物181增加了ERα Thr594的磷酸化水平，表明它增强了14-3-3与其ERα磷酸位点的结合，从而保护其免受磷酸酶的影响。

这些14-3-3/客户蛋白稳定剂表明，可以通过不同的筛选方法合理鉴定不同天然PPI的分子胶。这些方法可能适用于14-3-3之外的其他靶标，并且与前面描述的β-连环蛋白示例相似。

de Vink等人以14-3-3/客户蛋白复合体为例。描述了一种协同模型，用于根据稳定剂和结合配偶体之间的协同因子(α)以及稳定剂对载脂蛋白之一的内在亲和力来量化PPI稳定剂的功效-蛋白质(KDII)（下图）。协同作用依赖于FP测量（2D-FP蛋白质滴定）和基于蛋白质(R)或磷酸肽伴侣(P)和稳定剂(S)顺序结合的半数值热力学模型。结合配偶体通过KD与靶蛋白结合。在稳定剂存在下，增强的亲和力变为KD/α。当伴侣已与目标蛋白结合时，稳定剂存在下的KDII增强至KDII/α。该模型允许SAR 分析研发，稳定剂的功效归因于协同性或内在亲和力的变化。

2. Trametinib：MEK/KSR 蛋白互作稳定剂

据报道，FDA批准的MEK抑制剂曲美替尼(Trametinib)与天然PPI存在意外发现分子胶型相互作用。2020年，Khan等解析了在MEK抑制剂存在的情况下与假激酶KSR（RAS激酶抑制因子）结合的晶体结构（下图）。其中，药物曲美替尼(Trametinib)直接与MEK界面上的KSR结合，形成MG型三元复合物。Trametinib作为一种ATP非竞争性激酶抑制剂，占据了与ATP相邻的典型MEK抑制剂变构位点，但其3-取代苯乙酰胺基团也延伸到到达KSR相互作用界面的亚口袋中。与其他临床MEK抑制剂相比，这种苯乙酰胺是曲美替尼所独有的。该部分占据MEK-KSR界面处形成的口袋并与两种蛋白质形成接触。由于苯基乙酰胺和BRAF中的前螺旋αG环之间假定的空间冲突，曲美替尼还破坏了RAF-MEK复合物。然后利用结构信息设计一种名为曲美胶(Trametiglue)的化合物，以测试是否可以通过改变KSR-MEK和RAF-MEK的界面来克服对MEK抑制剂的适应性耐药性。曲美胶具有磺酰胺基团，而不是曲美替尼的乙酰胺基团，这使得在KSR-MEK界面上形成两个额外的氢键。免疫共沉淀分析显示，曲美替尼显着增强了BRAF的捕获，但曲美替尼没有，这表明小分子促进了BRAF与MEK结合。该策略可以通过靶向MAPK通路中与分子胶型分子的调节复合物的界面结合区域，进一步应用于MEK抑制剂的合理设计。

3. LSN3160440：GLP-1R/GLP-1 PPI的稳定剂

2020年，文献报道了LSN3160440的发现，这是一种分子胶，通过与受体(GLP-1R)和正位配体协同结合来稳定G蛋白偶联受体的活性状态构象[GLP-1-(9–36) ]。GLP-1-(9–36)是天然配体GLP-1(7–36)的代谢产物，虽然GLP-1(7–36)的功能上无活性，但仍保留与GLP-1R的弱亲和力。在EC20（20%最大有效浓度）存在GLP-1-(9–36)的情况下，使用表达GLP-1R的HEK293细胞筛选220,000种化合物库，以鉴定变构调节剂。多次SAR优化循环产生了化合物LSN3160440，它增强了GLP-1-(9-36)的效力和相对功效。使用冷冻电镜测定GLP-1R与LSN3160440与全长GLP-1、异源三聚体Gs和羊驼抗体Nb35的复合物（下图）。LSN3160440与GLP-1R的细胞外侧结合在跨膜螺旋TM1和TM2界面处形成的袋中。配体-受体和配体-肽相互作用也在TM1-TM2界面处形成。因此，LSN3160440同时结合GLP-1R和GLP-1，稳定新的界面并增强GLP-1(9–36)的内在活性以完全激活受体。LSN3160440代表了影响细胞表面信号传导的PPI稳定剂的第一个例子。

3. 分子胶诱导自缔合

与天然PPI稳定剂相反，有许多诱导自缔合的化合物实例，包括靶蛋白的同二聚或异二聚、寡聚或多聚。在大多数情况下，分子胶型自缔合作用机制是回顾性发现的。一个显著的对比是基于生物物理学的前瞻性发现tafamidis，它可以稳定转甲状腺素蛋白的四聚体，抑制其解离和聚集。Tafamidis用于治疗转甲状腺素蛋白家族性淀粉样多发性神经病患者，这是一种罕见的常染色体显性神经退行性疾病。2000年代，Kelly实验室确定运甲状腺素蛋白淀粉样蛋白形成的限速步骤是四聚体解离为单体；通过用小分子“伴侣”对四聚体进行动力学稳定，他们能够减缓解离并抑制淀粉样蛋白的形成。tafamidis的发现代表了一种合理的、基于结构的药物设计工作，它产生了first-in-class的治疗剂，并为发现新的寡聚蛋白稳定的分子胶铺平了道路。

3.1 BCL6 降解剂

BCL6抑制剂的开发是导致高聚蛋白的化合物的最新最著名的例子之一。这些化合物也可以归类为降解型，但高级聚合的特征使其与前面描述的降解剂有所不同。转录因子BCL6与淋巴恶性肿瘤和非霍奇金淋巴瘤有关，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤。BCL6作为转录抑制因子，通过锌指结合特定的DNA序列，并通过其BTV/POZ结构域招募转录共抑制复合物。BTB结构域是N末端的蛋白质相互作用基序，形成头尾相连的同源二聚体，并可以采用各种寡聚状态。2017年，Kerres等表发现BCL6的BTB结构域具有高度的成药性，并进行基于结构的药物设计来开发抑制剂。

对1,700,000种化合物的库进行了高通量FP筛选，检测共阻遏肽与BCL6的BTB结构域的相互作用。通过SPR、晶体学和生化ULight共阻遏肽结合测定进一步验证了命中分子机制。随后进行了基于结构的优化。有趣的是，除了BCL6抑制剂之外，还有一部分化合物被鉴定为BCL6降解剂。BI-3812充当抑制剂，而BI-3802充当降解剂。在结构上，作者将不同的活性归因于嘧啶-R2取代基；极性或带电部分产生非降解剂，而非极性和亲脂性不带电部分产生降解剂（下图）。 重要的是，与等效的非降解抑制剂相比，BI-3802快速诱导BCL6泛素化和降解，从而更强地诱导BCL6抑制基因的表达，并具有显著的抗增殖作用。

2020年，报道了BI-3802的冷冻电镜结构，并表明BCL6抑制剂的溶剂暴露部分有助于形成复合配体/蛋白质界面。BI-3802与BCL6-BTB结构域的结合触发了BCL6更高级的组装。聚合导致E3连接酶SIAH1对BCL6的泛素化增强，该酶识别结合位点远端的VxP基序。在结构上，BI-3802的二甲基哌啶部分直接与相邻BTB结构域同二聚体上的远端氨基酸相互作用。该化合物结合在BCL6二聚体之间的凹槽中，所得界面类似于晶体结构中观察到的二聚体界面。与BTB α的Tyr58形成直接接触，并与相邻二聚体(BCL6 γ/δ)上的Cys84形成疏水相互作用。在BTBβ的Arg28和BTB γ的Glu41之间观察到了关键的相互作用，形成了对二聚体-二聚体相互作用至关重要的盐桥。结构相似的抑制剂(BI-3812)缺乏BCL6聚合是由于较长的甲酰胺基团的空间冲突，如冷冻电镜结构建模所示。

同样在2020年，Bellenie等报道了BCL6及其共阻遏物之间的一系列PPI苯并咪唑酮抑制剂。CCT369260是BI-3802的类似物，具有改进的特性，是一种可口服的降解剂，可降低体内淋巴瘤异种移植小鼠模型中的BCL6水平。其他结构相似的化合物，例如25a，充当抑制剂而不是降解剂。作者还表明，在非降解剂25a和降解剂CCT369260的晶体结构中，结合模式相似，并推测取代基的性质而不是独特的结合模式可能决定了化合物的降解或非降解行为。一个合理的假设是吗啉环（化合物25a，抑制剂）中的氧将形成极性相互作用，而该位置的二氟部分（CCT369260，降解剂）将形成非极性相互作用。这一观察结果支持了针对BI-3812和BI-3802得出的结论。

3.2 PD-L1 分子胶

随着针对PD-1或PD-L1的单克隆抗体在临床上取得成功，据报道有几类小分子可作为PD-1/PD-L1抑制剂。其中有百时美施贵宝(BMS)于2015年首次公开的支架(WO2015/034820 A1)，其中包括一个具有单邻位取代的联苯子结构的芳香核。代表性的例子是BMS-8和BMS-202。初始生物学数据通过均质时间分辨荧光测定获得，当时没有披露更多的体外或体内数据。2017年报道了人PD-L1 与BMS-8 和BMS-202 晶体结构，并进行了几种其他生物物理方法的检测，包括蛋白质NMR和分子筛验证。在NMR研究中，这两种化合物解离了PD-1/PD-L1复合物，诱导了PD-L1的热稳定性，并且如晶体结构所示，导致以1:2的比例形成化合物-PDL1复合物。BMS-8和BMS-202均结合在两个单体界面处形成的圆柱形疏水袋中。该口袋在二聚体的一侧是溶剂可及的，但在另一侧受到ATyr56侧链的限制。两种化合物以相似的方式结合，并与二聚体界面上的热点氨基酸Tyr56、Met115、Ile116、Ala121和Tyr123形成关键相互作用，形成稳定的三元复合物。2-甲基联苯核心深埋在口袋中，与热点残基形成大部分相互作用，包括与ATyr56的T-堆积相互作用，与AMet115的π-烷基相互作用和BAla121，以及额外的疏水相互作用。在随后的研究中，报道了优化配体BMS-1166的晶体结构。BMS-1166也观察到了同源二聚化机制，BMS-1166是一种高效化合物，在二聚体界面显示出多种相互作用，并导致Tyr56重排。分子胶型二聚机制的阐明和联苯核心的明确作用迅速促成了许多后续的基于结构的优化工作。

最近，研究表明PD-L1 分子胶对降解途径具有明显的影响。BMS-1166阻断PD-L1糖基化，这是PD-L1和PD-1之间发生相互作用所必需的。此外，BMS-1166与PD-L1的结合可阻止新合成的PD-L1转运至高尔基体，从而限制进一步的糖基化，从而将后者捕获在内质网(ER)中。因此，ER中糖基化不足的PD-L1可能通过ER相关蛋白降解途径快速降解。与抑制蛋白质运输相反，2022年，Wang等人结果表明，化合物17（一种二聚化PD-L1的恶二唑双芳基类似物）通过诱导PD-L1内化和溶酶体依赖性降解，促进细胞表面PD-L1的减少。PD-L1 分子胶产生降解作用的根本分子原因尚未完全阐明。

3.3 JH-RE-06二聚化REV1

2019年，Wojtaszek等描述了化合物JH-RE-06作为诱变跨损伤DNA合成抑制剂的分子胶型作用机制。该化合物充当REV1的二聚化诱导剂，从而成为REV1-REV7 PPI的破坏者。众所周知，DNA损伤性化疗药物（例如顺铂）会产生DNA损伤，而高保真DNA聚合酶无法修复这种损伤。为了以复制保真度为代价绕过损伤位点，在称为跨损伤合成(TLS)的过程中使用了专门的DNA聚合酶。在哺乳动物细胞中，TLS是一个两步过程；首先，插入TLS DNA聚合酶（POLη、POLι、POLκ和REV1）引入与病变相对的核苷酸，然后引入延伸的TLS DNA聚合酶，例如B家族聚合酶复合物POLz ( POLz：REV3L/ REV7/ POLD2/ POLD3)延伸3'末端。在这些TLS聚合酶中，REV1和POL z在顺铂存在下癌细胞的存活中发挥着重要作用。因此，抑制REV1-POL ζ相互作用是一种有前途的策略，可以使癌细胞对顺铂等化疗药物敏感并防止获得耐药性。然而，开发具有高特异性和体内有效的小分子抑制剂一直具有挑战性。

作者重点研究了REV1和POL ze之间在进化上保守的相互作用，特别是针对REV1 C末端结构域(CTD)和POL ze的REV7亚基上的浅袋。ELISA测定旨在筛选特异性靶向REV1 CTD 与 REV7结合表面以破坏REV1-REV7相互作用的抑制剂。筛选了10,000种结构不同的化合物，最终鉴定出化合物JH-RE-06，该化合物在10 μM浓度下可抑制REV1-REV7相互作用。通过定量AlphaScreen检测进行后续验证，显示IC50值为0.78 μM，与ITC解离常数非常一致(Kd= 0.42 μM)。ITC显示蛋白质与配体的化学计量比为2:1 (REV1:化合物)。共晶结构出人意料地揭示，虽然REV1 CTD的保守与 REV7结合表面是JH-RE-06的靶点，但该化合物通过诱导其二聚化与REV1 CTD结合，与ITC观察到的2:1比例一致（下图）。此外，在三元复合物中观察到REV1 CTD亚基C端尾部的不同构象，表明不对称二聚体的形成。在二聚体界面中形成了多种配体-蛋白质相互作用，包括几种疏水相互作用和直接极性相互作用。形成的REV1 CTD二聚体为JH-RE-06创建了一个大的结合袋，几乎所有化合物的官能团都与单体相互作用。 此外，二聚体的形成隐藏了REV7结合表面，从而阻止了REV1 CTD与REV7和POL ze募集的相互作用。该化合物的进一步评估表明，它可以使肿瘤对顺铂敏感并减少体外诱变。在人类黑色素瘤的异种移植小鼠模型中，JH-RE-06与顺铂的共同给药成功抑制了肿瘤生长并延长了动物的生存期。正如作者强调的那样，小分子可以令人惊讶地靶向曾经被认为不可成药的动态且看似无特征的蛋白质界面。

3.4 NVS-STG2寡聚STING

2023年，报道了一种分子胶样化合物(NVS-STG2)激活人类STING（干扰素基因刺激因子），从而诱导STING的高级寡聚化。STING是一种二聚跨膜接头蛋白，因其在人类对感染的先天免疫反应中的作用及其抗肿瘤活性而被广泛研究。其活化需要高级寡聚化。激活是通过环状二核苷酸（例如cGAMP）与位于STING C末端胞质区域的配体结合结构域(LBD)的结合而发生。N末端区域形成跨膜结构域(TMD)，其中包括来自每个亚基的四个跨膜螺旋，可稳定二聚体状态。

为了寻找STING的小分子激活剂，在含有干扰素刺激反应元件荧光素酶(ISRE-Luc)报告基因的THP1双细胞中进行了HTS表型筛选。采用示差扫描荧光法对命中化合物NVS-STG1进行了表征；与cGAMP不同，NVS-STG1不与人STING的LBD结合。优化的类似物NVS-STG2显示出超过100倍的ISRE-Luc报告基因诱导能力，并强烈诱导IRF3（STING通路下游的关键转录因子）的磷酸化。光亲和标记和定量化学蛋白质组学证实NVS-STG2对STING有直接影响。此外，通过体外测定，通过使用天然凝胶监测纯化的STING的高级寡聚化，证实了NVS-STG2对STING的激活。在没有配体的情况下，STING主要以二聚体状态存在。在cGAMP或C53（一种最近被证明可以结合在人TMD的隐秘口袋中的疏水性化合物）存在的情况下，形成相对较小的高阶寡聚物。NVS-STG2 显著诱导高阶寡聚化。cGAMP、C53或两者与NVS-STG2的组合促进了更多更大寡聚体的形成，表明了不同结合位点被靶向。

结构生物学证实并进一步解释了这种低聚物形成的激活机制。STING与cGAMP和NVS-STG2复合物的冷冻电镜结构在4 Å分辨率下显示形成了由大约3-6个二聚体组成的低聚物。STING在2.9 Å处与cGAMP/ C53/ NVS-STG2结合的冷冻电镜结构显示出更长、更丰富的寡聚体，由10-30个二聚体组成。所有三种配体都具有明确的密度；两个NSV-STG2分子与两个相邻STING二聚体的TMD之间的界面结合，而cGAMP与LBD结合，而C53与每个STING二聚体内的TMD口袋结合。在这两种冷冻电镜结构中，NSV-STG2有效地充当了MG，增强了两个STING二聚体的界面，并与两个蛋白质表面形成稳定的相互作用（下图）。总体而言，作者严格证明了NVS-STG2作为分子胶的作用机制，并通过引入可与口袋结合而不允许并排的大化合物，为合理开发STING激动剂甚至可能的STING拮抗剂提供了结构基础。

3.5 MERS-CoV非天然二聚化分子胶

2020年，发现了一种非天然PPI的正位稳定剂，用于针对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。与之前的N-NTD单体结构相比，MERS-CoV核衣壳蛋白(N-NTD)的N末端结构域的结晶揭示了非天然二聚体界面。蛋白质表达过程中存在的两个非内源N端载体融合残基（His37和Met38）促进了二聚化。交联实验和二聚体结构的进一步分析表明，残基Trp43对于形成容纳载体融合残基并介导二聚化的疏水袋至关重要。针对热点残基Trp43进行了基于结构的虚拟筛选。根据形状和疏水互补性过滤命中结果，并选择三种化合物进行进一步评估。其中之一，5-苄氧基禾碱(P3)，能够通过荧光热稳定性测定稳定野生型MERS-CoV N-NTD。具有全长野生型MERS-CoV N-NTD的化合物P3的晶体结构显示N-NTD为二聚体，化合物P3与两个单体形成多重疏水相互作用（下图）。小角X射线散射和基于细胞的检测进一步表明，化合物P3诱导异常全长N蛋白寡聚化，减少MERS-CoV核衣壳蛋白，并抑制N蛋白表达。100 μM的化合物在48小时后停止了Vero6细胞中的病毒产生和复制。

3.6 ISRIB 稳定eIF2B全酶的活性十聚体形式

真核生物综合应激反应（ISR）感知并整合不同的应激源。ISR重新编程翻译并控制蛋白质稳态，为细胞修复损伤或诱导细胞死亡提供检查点。ISR由一般真核翻译起始因子eIF2的磷酸化控制。四种上游激酶（PERK、PKP、GCN2、HRI）由不同的应激条件激活。反过来，它们磷酸化eIF2 (eIF2α)α亚基中的Ser51。eIF2结合GTP和起始子Met-tRNA形成三元复合物(eIF2-GTP-Met-tRNAi)，然后与40S核糖体亚基结合形成43S前起始子复合物，扫描mRNA的5'UTR起始AUG密码子。eIF2α中Ser51的磷酸化使eIF2成为其鸟嘌呤交换因子(GEF) eIF2B的竞争性抑制剂。磷酸化eIF2与eIFB2的结合可阻止eIF2复合物与GTP的相互作用。因此，当Ser51被磷酸化时，三元复合物的形成被阻断，并且翻译起始被减少。eIF2B和eIF2相对丰度的差异表明，即使是总eIF2的一小部分的磷酸化也会产生显着的细胞效应。虽然磷酸化会减少一般蛋白质合成，但它允许优先翻译一些5'UTR中包含上游开放阅读框的mRNA。

2013年， 对PERK信号传导抑制剂进行了基于细胞的筛选，该信号传导位于ISR和维持ER中蛋白质稳态的未折叠蛋白质反应的交叉点。作者使用工程化荧光素酶报告基因检测筛选了约107 000个 化合物的文库，该检测可以监测活细胞中的PERK激活。使用采用荧光报告基因和显微镜读数的正交测定对命中进行分类；28种化合物经过验证。其中一种经过验证的化合物是一种称为ISRIB（整合应激反应抑制剂）的对称化合物，它能够非常有效地阻断细胞中的ISR（IC50= 40 nM）。合成了两种非对映异构体，反式ISRIB的效力比顺式ISRIB强100倍（IC50分别为5和600 nM）。ISRIB的进一步验证表明，ISRIB不影响PERK磷酸化或激酶活性。相反，用ISRIB处理的细胞对eIF2α Ser51磷酸化的影响具有抵抗力。ISRIB具有良好的药代动力学特性，可以穿过血脑屏障，并在啮齿动物中进行了进一步评估，它增强了认知功能并增加了长期记忆。ISRIB的总体效果表明eIF2α磷酸化在高级脑功能的调节中发挥着重要作用；然而，此时ISRIB的分子靶点尚不清楚。

在ISRIB被鉴定后不久，两篇结构论文证明eIF2B是一个杂十聚体复合物。2015年，两个独立的研究小组几乎同时报道了机制研究，揭示了eIF2B是ISRIB的分子靶点。Sidrauski等人使用无偏倚的遗传筛选和结构/活性分析表明，ISRIB是eIF2B的激活剂，诱导细胞中eIF2B的自缔合，并增强eIF2B的GEF活性。分子的对称性对于细胞中激活的eIF2B的稳定至关重要，这得到了进一步SAR的支持。另一组研究人员通过筛选培养的哺乳动物细胞中的体细胞突变来探索ISRIB的作用机制，这些突变逆转了ISRIB对ISR的影响。这项研究表明，ISRIB靶向eIF2和eIF2B之间的相互作用，并且独立于eIF2磷酸化发挥作用。2016年，描述了ISRIB类似物的全面SAR，改进的类似物具有皮摩尔级IC50，通过激活eIF2B并允许全局蛋白质合成利用残留的未磷酸化eIF2α进行，从而使细胞对eIF2α磷酸化的影响不敏感。作者假设这些化合物稳定了eIF2B蛋白复合物的形成。

ISRIB结合模式的证明于2018年披露，当时Tsai等报道了冷冻电镜结构（下图）。完全活性的十聚体人源 eIF2B全酶的形成取决于两个相同的四聚体子复合物的组装，以及随后eIF2Bα同二聚体的结合。ISRIB结合在十聚体eIF2B中心对称界面处的深裂隙中。在结构上，δ亚基N端环中的残基对ISRIB（δVal177、δLeu179、δLeu485）与疏水相互作用的结合有显着贡献。结合位点的中心由β亚基中的残基（βAsn162、βHis188）形成，这些残基更接近ISRIB的极性部分，而疏水性残基也参与其中（βVal164、βIle190）。一个关键的相互作用是ISRIB的乙醇酰胺α-碳的两个C-H键之一与βHis188的芳香组氨酸环之间的C-H-π相互作用；His突变为Ala导致ISRIB十聚体失去稳定性。值得注意的是，ISRIB并未与α亚基形成直接相互作用，而是稳定了β亚基和δ亚基的对称界面，从而增强了eIF2B(α2)的稳定结合。

所有这些诱导的自关联的例子都被选为化合物诱导效应的代表性案例。然而，值得一提的是，这可能并不总是高阶蛋白质聚合的真正原因，因此研究潜在的机制至关重要。Morreale等人报道了属于后一类的一个不寻常的例子。作者鉴定了一个针对范可尼贫血泛素结合酶Ube2T的片段。尽管生物物理和生化特征支持观察到的活性，但共晶结构表明观察到的效应实际上是由污染的锌离子引起的。令人惊讶的是，锌与活性位点半胱氨酸的结合诱导了Ube2T中前所未有的结构域交换，从而导致靶点三聚化。这是否是金属离子的独特情况，或者小分子是否能够引起域交换还有待观察。然而，正交测定和结构信息对于破译化合物诱导的自关联的原因至关重要。

4. 总结

分子胶已进入药物发现领域并从根本上改变了我们对如何调节PPI的理解。曾经通过传统策略被认为无法成药的目标已成功地被分子胶靶向。由于分子胶可以针对天然和新形态的PPI，因此现在有大量机会以十年前不可想象的方式调节PPI。必须开发新的概念来描述分子胶的特征，例如PPI界面的形状互补性、协同性和化合物诱导的临近性，现在这些概念使药物搜寻者能够以更合理的方式识别它们。更好地理解PPI界面的结构和动力学（很大程度上归功于冷冻电镜）对于增强我们对分子胶在原子水平上如何工作的理解至关重要。特别是，MG与蛋白质界面的两侧结合，诱导或增强PPI本身的形成；分子胶/蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用定义了一个高度合作的复合体。

当像CELMoD这样的分子胶首次被表征时，人们认为没有分子胶就不会存在PPI，因此是“新形态”相互作用。相比之下，像褐藻类这样的天然产物可以稳定现有的相互作用。进一步的结构和功能分析表明这两种想法存在于一个连续体中。例如，蛋白质之间通常存在内在亲和力和形状互补，例如DDB1-CDK12的例子，这种亲和力太弱而无法产生生物效应，但通过分子胶稳定，分子胶通过形成“粘合互补表面”与界面处热点残基的相互作用。因此，分子胶将弱亲和力的PPI转化为高度合作的三元复合物。热力学建模提供了一个框架来量化不同的结合相互作用并计算三元（或更大）复合物的内在协同性。

正如这里的例子所示，可以采用多种策略来合理地发现分子胶。一些方法包括以下内容：

基于细胞的筛选：传统上，表型筛选导致了FIC药物的发现，而基于靶标的方法则导致了更多FIC药物的发现。虽然表型筛选直接产生细胞活性化合物，但定义分子靶点可能很复杂。就 分子胶 而言，几家公司已经筛选了细胞中的分子胶样文库，并监测了感兴趣靶标的降解情况。这种方法将靶标标反向鉴定。正如细胞周期蛋白K降解剂的情况所示，不同的表型筛选方法可以非常成功地鉴定降解型分子胶。

适合稳定的生物物理测定：通常，分子胶 口袋中基于靶标的筛选使用邻近测定，例如FP/各向异性或能量转移，用于监测PPI的形成。当使用这些测定形式筛选抑制剂时，通常仅需要测量EC50（抑制50% PPI时的化合物浓度）。然而，对于稳定性测定，必须评估两个独立的参数-EC50和功效/协同性的量化。这将包括折叠稳定性的量化，即在分子胶存在的情况下appKd从天然二元复合物到三元复合物的转变。根据系统的复杂性，也可以应用α因子确定和热力学建模。在生物物理环境中筛选功能获得而不是抑制需要修改筛选条件。通常，FP/TR-FRET筛选在EC20上进行。随着分子胶效率的提高，遇到比检测的理论动态范围更严格的亲和力的情况并不少见。为了避免这个问题，需要改变试剂的浓度。然而，相关的挑战是有限的检测窗口。在某些情况下，生物物理测定依赖于使用肽来简化筛选。需要谨慎确保系统的简化不会过度损害其生物学相关性或人为地减少鉴定分子胶的机会；例如，ZBTB16有九个锌指结构域，到目前为止，其中两个可以被诱导与不同的分子胶结合CRBN。一般来说，生化和生物物理测定必须保持谨慎，因为为了精确性，我们简化了系统并可能牺牲一些生物学背景。

共价分子胶：分子胶发现的另一个挑战是三聚体问题，特别是在固有亲和力低的系统中和/或当其中一个目标本质上无序时。三聚体问题是指蛋白质和分子需要同时结合，这在统计上是不可能的。对于IMiDs/CeLMODs，MGDs对CRBN具有高亲和力；然而，在一般情况下，分子胶与双方的结合较弱，但与PPI复合物具有较高的协同性。在这种情况下，可逆或不可逆共价筛选模式特别适合，因为共价增强了对其中一种蛋白质的亲和力，并且可以减缓结合动力学以接近二体结合。共价筛选方法包括使用不可逆结合物的化学蛋白质组学和使用不可逆或可逆结合物的生物物理筛选。可逆共价配体，例如筛选14-3-3的醛和二硫化物，具有热力学结合（相对于14-3-3结合）的进一步优势。因此，化合物被鉴定为分子胶，因为三元复合物是最稳定的，而不仅仅是形成最快的。

不用说，分子胶的发现令人兴奋不已，并且这个术语在最近的出版物中越来越频繁地出现。然而，我们认为这个术语不应该被轻易使用。相反，应该证明化合物可以起到分子胶的作用。首先，应该举例说明在胶水存在下三元复合物的形成，理想情况下具有结构，但也可以使用生物物理方法、基于细胞的测定和/或诱变。定义分子胶的另一个关键因素是PPI界面协同性的证据，因为分子胶对至少一种结合蛋白表现出弱或低的亲和力。对于双功能分子，例如PROTAC，协同性并不是严格要求的，因为在某些情况下，具有负协同性的PROTAC仍然能够导致靶标降解。