今天分享一篇苏黎世联邦理工学院Jörg Scheuermann教授的最新研究，为下一代固相合成高纯度DEL库提供了方向。
第一代使用 DNA 编码化学库 (DEL) 筛选发现的药物已进入后期临床开发。然而，DEL 技术仍然存在化学纯度较差导致性能欠佳的问题。在这项工作中，作者报告了一种通过磁珠合成后自净化释放 DEL 来克服这个问题的技术。每个组装的文库成员的第一个和最后一个砌块都与珠子连接，系链可通过相互正交的化学作用裂解。第一个和最后一个系链的顺序裂解以及中间的洗涤确保了最终的文库仅包含完全完整的化合物。通过这种方法获得的出色纯度能够实现化学显示和编码的直接关联，允许扩大化学反应范围，并促进使用更多多样性元素，同时大大提高选择中的信噪比。
使用包含单独编码序列的大型文库极大地促进了对靶蛋白具有高亲和力的配体的发现，通过简单的基于亲和力的选择实验联合筛选。基于自然翻译机制的展示技术可提供多肽配体，而 DNA 编码化学文库 (DEL) 的特点是化学合成的小分子结构与独特的编码 DNA 片段相连。DEL 通常通过组合化学合成制备，其中合成和编码循环交替进行。由于 DEL 技术价格低廉、高效且能够使用大量化学砌块和反应类型，因此它已在工业界和学术界常规用于小分子药物发现，并迅速为基础细胞和分子生物学以及蛋白质组学研究提供有价值的化学探针。
然而，DEL 技术的当前标准方案远非最佳：DEL 合成是在水溶液中通过分流和池（split-and-pool）程序在通常两到四个周期内进行的，其中通过酶连接来偶联和编码多组构建块DNA 序列。由于各个反应产率因砌块而异，并且取决于所使用的水和 DNA 兼容反应类型，因此所需化学结构的最终显示会随着分流和池轮次数的增加而减少，这会导致截断的增加结构。这种截断结构的出现最终导致基于亲和力的选择中配体发现的严重限制。此外，次优的化学转化自然限制了药物发现中可达到的化学空间，限制了 DEL 技术的实际用途——例如，对于大环结构领域，这对于药物应用和化学生物学研究的许多领域变得越来越重要。此外，作为化合物库，DEL 无法通过分析工具评估显示产量。尽管单个条形码的出现可以通过聚合酶链式反应(PCR) 扩增后的高通量 DNA 测序来确定，但条形码效率与化学合成产量并不相关。
液相 DEL 合成的一个明显替代方案是在固相支持物上构建 DEL，正如 S. Brenner 和 R. Lerner 以及 M. Gallop 及其同事在 1992 年概念性设想的那样，他们提出了交替合成同一珠子上的肽和 DNA 链。然而，尚未报道使用固相完全合成大而纯的DEL，释放后可以进行基于亲和力的选择。
这里提供了一种基于固相合成然后自纯化释放文库的DEL构建方法，从而解决了上述限制，促进了更复杂、以及容量更大DEL的使用。
该方法的特点是在磁珠上以分离和池的方式合成和编码 DEL（图 1）。通过利用具有两个正交连接子的设计，可以获得并释放纯净且结构完整的 DEL 成员。利用这一概念合成了三环 1100 成员 DEL，其中含有碳酸酐酶 (CA) II/IX 配体4-磺胺基苯甲酸 (SABA)作为 11个第三环结构单元之一。该文库在经过和不经过自纯化的情况下从磁珠中释放出来，并在基于亲和力的选择中对两种 CA 亚型进行了测试。虽然在两种情况下自纯化(SP，self-purification)DEL 中都可以观察到 SABA 配体的高富集，但对于非自纯化 (非 SP)DEL，SABA 的富集要低得多。此外，与标准 DEL 技术不同，SP DEL 的测序计数可定量实际的化学产率。
另一个优点是，由于合成是在磁珠上进行的，因此与最先进的 DEL 溶态合成相比，具有可以使用无水条件反应的优势。事实证明，这不仅可以实现酰胺键形成的优异收率，而且还能够进行与水不相容的 SnAP 反应以及酸介导的胺脱保护，这对于正交 DEL 合成来说是非常理想的方法（图2）。磁珠的高效合成与自清洁策略相结合，能够合成高纯度的五结构单元化合物以及包括众所周知难以偶联的结构单元的化合物。
在下面，将更详细地描述自清洁 DEL的制备备和性能测试等方面。
1. DNA编码磁珠固相合成
因为在固体载体上的合成提供了从溶液中分离分子的物理手段，试图利用这一特性在DEL合成过程中清洗掉截短的产物，并最终释放最终产物。使用了基于两个正交连接子的纯化方案，该方案仅适用于那些正确组装的化合物(图1A)。三功能支架通过第一个碱基可裂解的连接子连接到氨基修饰的固体载体上，而其他两种功能分别用于连接不断增长的DNA条形码和化学部分。支架接合后，进行合成、加帽和编码的拆分和聚合循环。第二种氧化可裂解连接子被安装在最后一种化学物质上，提供与固体载体的第二种共价连接。在第一个连接子断裂时，只有那些仍然通过第二个连接体连接的化合物留在固体载体上，而所有被封住的截短体都被释放并被冲走。在彻底洗涤珠后，通过第二连接体的氧化裂解释放所需产物。作者选择了小直径(2 mm)的磁珠，因为这样既可以自动使用标准磁粒子处理器，也可以采用可靠的分池程序，以可管理的大型库。
图 1. 磁珠固相合成 DEL 构建和自净化
(A)磁珠自清洁DEL合成的示意图。DEL的合成从DNA连接到通过连接子1(浅棕色)连接到磁珠的支架(如图蓝色圆圈所示)开始。(i)珠子被分成不同的反应容器，以便与第一组化学支架(粉色圈)反应。(ii)每个独特的DNA条形码通过酶反应连接到每个支架的DNA上，从而编码每个分子。不同编码的珠子被混合在一起。(iii)重复分裂、反应、加帽、编码和混合的循环，直到得到所需的化合物。(iv)连接子2(绿色以连接终端构件(橙色圆圈)到固体支架。连接子不能用于封顶、截断结构。(v)接头1(浅棕色)被切割，从固体支架释放所有截短物。完全合成的分子通过连接子2(绿色)保留在固体载体上。(vi)洗涤后，SP DEL通过连接子2的裂解从磁珠中释放出来，溶液中的DEL随后可用于基于亲和力的测试。
(B)自清洁DEL的合成策略。合成从DNA连接到Pra支架(深蓝色)开始，包含一个胺官能团，用于与砌块反应。Pra通过碱基可裂解的HMBA连接子(浅棕色)连接到固体支架(灰色球体)。用具有叠氮化物修饰的侧链的赖氨酸对固体载体进行官能化以提供用于稍后安装连接剂2(橙色)的手柄。
图 2. 通过固相合成实现 DNA 相容反应磁珠。
首先，利用标准偶联条件（图2、A-B）和各种天然和非天然、容易和难以偶联的氨基酸构件，在非质子溶剂中研究了基于9-氟烯氧基碳基（Fmoc）的SPPS（ solid-phase peptide synthesis）。使用5个反应循环生产了两种DNA偶联化合物（图3，A和B），包括天然氨基酸构砌块、及三种化合物，其中包括出了名的难以偶联的空间受阻的2-氨基异丁酸（Aib）基团（图3，C-E）。化合物C加入Aib一次，化合物D和E加入Aib两次，其中Aib残基以甘氨酸间隔甚至顺序包含（图3，C-E）。在切割HMBA连接子后，观察到所需产物和不同数量的截断中间体的有效释放，而通过自纯化的释放了纯产物（图3，A-E）。
图 3. 单个 DNA 编码化合物和DEL。
固相合成方案还允许无水的高合成的转换，然而，这在水相条件下是非常具有挑战性的，如Boc和Mtt去保护（图2，C-D）。此外，在磁珠上实现了水不相容的SnAP化学，有望实现具有高结构多样性的异环和螺旋环DELs（图2，F-G）。综上所述，各种化学转化可以通过磁珠上的DNA兼容合成来促进，而这对于基于溶液的DEL合成方案是不可能实现的。
2. 基于磁珠的自纯化释放系统
在磁珠上合成固相DEL的适用性和潜力，作者试图实现合成的DNA偶联物的自动纯化系统。该策略是基于使用两个正交可裂解的无束连接子。作为第一个连接子，使用了上述碱基可裂解的HMBA连接子，而第二个连接子是由 Pentelute课题组提出的氧化可裂解的isoseramox linker。该连接子的特点是一种醛，能够通过还原胺化偶联到最后一个构建块的游离初级氨基端（图2E）。在醛的近端引入一个乙酰保护基团，以提供适当的空间位阻，以防止还原胺化过程中的双烷基化。在第一个连接体的裂解过程中，该乙酰保护基团被去除，从而为第二个连接子的氧化裂解奠定了基础（图1B，步骤v）。这两种连接体的裂解释放出一个羧基和一个游离胺，在释放后产生一个天然肽。
为了测试该双连接体设计，作者合成了由3个或5个砌块组成的单个DNA编码化合物（图3，A-E）。通过偶联Fmoc-Lys（Mtt）-OH制备氨基修饰的磁珠，然后通过Fmoc脱保护和偶联HMBA修饰磁珠。然后通过酯化反应将HMBA偶联到三功能支架Fmoc-Pra-OH上。Mtt脱保护后，将DNA头安装在Pra的炔基上，然后将赖氨酸与5-azidopentanoic acid偶联（图1B）。在Pra支架的Fmoc去保护后，通过添加第一个双功能化学砌块，在游离胺上启动DNA编码化合物的化学合成，然后用乙酸酐盖帽和Fmoc去保护。在通过还原胺化将连接子2偶联在最终的构件上之前，反应、封盖和脱保护步骤重复了多达5个循环。在铜催化的点击偶氮戊酸修饰的赖氨酸上（图1b，步骤iii）后，连接1被氢氧化锂和连接2的乙酰保护基团裂解，得到 vicinal aminol。然后所有封顶截断结构被释放和冲走（图1B，步骤iv），只有完整的产物仍然结合在磁珠和可以通过氧化裂解释放（图1B，步骤v）。总之，自纯化系统应用于5个单元的DNA编码化合物，并得到了高纯度的DNA偶联物（图3，A到E）。
3. SP DEL在基于亲和关系的选择中的性能
在建立了磁珠固相合成和双连接体自净化方法以提供纯DNA偶联物之后，作者研究了在有或无自净化产生的三个构建模块组成的DEL的性能比较(图3F)。三循环DEL包括CA配体SABA[(Kd) (CAII) = 600 nM;Kd (CA IX) = 100 nM]，通过分流-池（split-and-pool）的方法，使用三组天然的和非天然的氨基酸砌块，其中也包括空间受阻的Aib氨基酸。前两组砌块由10个不同的氨基酸组成，而在第三个循环中使用了11个构建模块，产生了1100个不同的DEL。为了更好地显示SP和非SP del之间的差异，将阳性对照构建块3_11, SABA修饰的赖氨酸，只包含在其他循环3构建块的10%；而3_10，乙酰化赖氨酸，占剩下的90%。作者特意选择了第三个循环中的阳性对照，以反映所有三个合成周期后化合物的最终表现。对非SP DEL和SP DEL进行对两种CA亚型亲和力选择性的比较。对未选择的DEL (naïve)以及选择性的结果进行PCR扩增和Illumina Novaseq测序，并确定每个DEL成员的计数。
对于naïve库，非sp DEL(图3G)欺骗性地显示了所有库成员的同质分布，因为所有编码标签都以相似的数量出现，而不管所需的各自化学部分是否显示。相比之下，naïve SP DEL(图3H)显示了一个更加异构的分布，对于那些没有成功合成的库成员也包含了。因此，自净化在化学显示和编码之间提供了1:1的相关性，因此可以直接了解每个显示的文库成员的合成化学产率，因为只有正确合成的DNA -化合物共轭物存在。例如，含有空间受阻氨基酸Aib的化合物在SP DEL中明显未得到充分表达(图3H，2 = 6和图3I)，反映了它们的不完全转换，但各自截短的代码仍然存在于非SP DEL中(图3G，2 = 6和图3I)，这构成了在溶液中合成的分流-池DEL的HIT识别的一个常见问题。当在针对CA IX的基于亲和力的选择中使用这两种DEL时(图4,A和B)，通过自纯化获得的纯度的效果变得明显:虽然包含SABA构建块的化合物可以从非SP和SP DEL中回收(图4,A和B，3 = 11)，但在SP DEL中观察到明显更好的富集。鉴于较低亲和力的SABA-CA II相互作用，SP DEL和非SP DEL的选择之间的差异甚至更明显。采用线性模型[R2= 0.9998]确定自净化对选择结果的定量效应。图4C显示了CA II和CA IX选择中SP(绿色)和非SP del(红色)选择的信号背景比(富集)。接下来，确定两个del之间的富集倍数变化(图4D)。SP - DEL平均使选择性富集提高8.31倍(P≪0:01;CA II为9.16倍）;在DEL选择中，提高富集度和信噪比有助于从较大的文库中可靠地发现配体，尤其是低亲和力的配体。值得注意的是，不仅在整体水平上观察到这种更大的富集，而且在文库中的每个含SABA的化合物中都观察到这种富集(图4D)。
图4. 使用SP和非SP DEL的基于亲和力的选择。
总结
通过这项工作，作者建立了一个强大的合成平台，通过结合固相合成和DEL的选择性自净化释放来构建高纯度的DEL，以用于基于亲和力的选择。获得的DEL的非凡纯度直接转化为基于目标的选择的质量，因此，通过在背景上的更高的命中富集，将大大促进命中的发现。相信SP DEL技术将成为小分子药物发现的通用和有价值的技术，并允许在小分子和基于翻译的多肽配体发现之间架起尚未开发的化学空间。
非DEL相关专业，若有错误欢迎批评指正。
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