今天分享一篇，BioAtla 利用抗体条件性活性激活平台，产生可以在特定生理条件下激活或失活的抗体-EpCAM x CD3 双特异性抗体（BA3182, 临床I 期）。BioAtla是美国以及Nasdaq上市生物科技公司，具有平台生物条件性活性激活研究平台（Conditionally Active Biologics™，CAB)，专注于以此开发条件性激活的疗法。
在癌症中，Warburg 效应有助于形成一种特有的微环境，当抗体靠近肿瘤时，该微环境会激活抗体，而如果抗体远离肿瘤，则可逆地使抗体失活。BioAtla 利用微环境产生的化学物质，例如碳酸氢盐和硫化氢，生成一种新颖的化学开关。这些分子在生理条件下带负电荷，并与蛋白质表面的正电荷区域相互作用。在肿瘤微环境的酸性条件下，它们被中和并从蛋白质表面释放，独特地允许 CAB 抗体与其靶标结合并攻击肿瘤细胞。
利用该平台可适用于ADC，双抗，单抗等，其主要管线如下:
上皮细胞粘附分子 (EpCAM) 是一种跨膜糖蛋白，在癌症生物学中发挥多种作用。EpCAM 是一个有吸引力的治疗靶点，因为它在大多数实体瘤中表达。然而，靶向 EpCAM 一直具有挑战性，因为它在正常上皮组织中也高表达。由于严重的细胞因子释放效应以及严重的靶向、非肿瘤药物相关毒性，开发 EpCAM 特异性 T 细胞接合剂的初步尝试并未成功。
本文报道了了新型条件性激活的双特异性抗体，可在酸性肿瘤微环境中EpCAM 和 CD3 结合。在健康组织中，通过一种新颖的双重 CAB 选择大大减少了与 EpCAM 和 CD3 的结合，其中每个结合域都被称为蛋白质相关化学开关 (PaCS，Protein-associated Chemical Switches) 的生理化学物质的存在独立阻断。CAB 抗 EpCAM T 细胞接合剂表现出预期的双特异性结合特性，并通过在肿瘤微环境中募集 T 细胞来介导 EpCAM 阳性癌细胞的有效裂解。在非人灵长类动物中显著降低了毒性，表明治疗指数前所未有地扩大了100倍以上。这些临床前结果表明，双 CAB 双特异性抗体可能是一个强大且安全的治疗平台，对于表达 EpCAM 的肿瘤患者来说也是一种有前途的 T 细胞激活治疗。
使用双特异性抗体以非 MHC 限制的方式重新定向 T 细胞的细胞毒活性的免疫肿瘤疗法已得到临床验证。CD19 × CD3双特异性 blinatumomab 是美国食品和药物管理局 (FDA) 批准的第一个 T 细胞接合剂 (TCE)，在 B 细胞急性淋巴细胞白血病患者中具有出色的单药活性。
最近，针对BCMA（elantramab、teclistamab）、CD20（epcoritamab、mosunetuzumab、glofitamab）、DLL3（tarlatamab）、gp100（tebentafusp）和GPCR5D（talquetamab）的其他 TCE 已获得 FDA的批准。尽管TCE在临床上取得了成功，但≥30%的患者仍观察到危及生命的不良反应，例如细胞因子释放综合征（CRS）。
近年来，针对 EpCAM 的 TCE 也作为免疫介导的抗癌治疗的有希望的药物而出现。Catumaxomab，一种大鼠/小鼠混合双特异性药物，于 2009 年在欧盟批准用于治疗恶性腹水，但后来由于商业原因从市场上撤回。此外，Catumaxomab的全身给药是不可能的，因为对实体瘤患者重复静脉注射Catumaxomab会导致致命的药物相关事件，包括细胞因子释放综合征和严重肝毒性，导致急性肝衰竭和研究终止。Solitomab (MT110)，是另一种 EpCAM 靶向 TCE 显示出有益的临床结果，但其开发受到剂量限制毒性的阻碍。根据I临床期研究结果，SOLITOMAB 在实体瘤中的已停止进一步开发。因此，消除与 EpCAM 靶标相关的在靶、非肿瘤毒性，并结合肿瘤特异性 T 细胞激活，将有可能实现强大的、广谱的、泛抗肿瘤治疗，并提高患者的总体生存率。
双特异pH条件性激活双抗的设计原理
本研究旨在生成在正常碱性生理条件（≥pH7.4）下减少与 EpCAM 和 CD3 结合的 CAB 双特异性抗体，同时在 TME 条件（pH5.8-6.7）下保持良好的结合。仅在 TME 中有活性的 CAB TCE 预计可降低外周靶向肿瘤外毒性。双特异性分子基于肿瘤靶向臂的 IgG1-N297Q 主链（无效应功能的非糖基化 IgG1）。将抗CD3单链可变片段（抗CD3-scFv）抗体融合至每条轻链的C末端。所得分子是分子量约为 200 kDa 的同二聚体，具有两个 EpCAM 结合域和两个 CD3 结合域（图1a)。
图 1.BF-588-DualCAB 的体外表征。
通过使用重组人 EpCAM 胞外结构域 (huEpCAM-ECD) 免疫 BALB/c 小鼠 (Genscript)，开发了针对人 EpCAM 的抗体。克隆了来自杂交瘤的可变结构域，该可变结构域表现出与重组人和食蟹猴EpCAM胞外结构域（ECD）以及细胞表面表达的人和食蟹猴EpCAM的结合活性，并进一步表征了它们的结合和体外功能活性。选择杂交瘤克隆BA-105-12C10F12用于 CAB 过程。
酸性细胞外 pH 值是 TME 的一个关键特征，因为癌细胞的糖酵解代谢支撑着癌细胞的持续复制。筛选了在所有六个 CDR 环中引入突变的克隆 BA-105-12C10F12 变体文库，以在 pH6.0（TME 条件）和 pH7.4（正常碱性生理条件）下与重组人 EpCAM ECD 结合。筛选产生了几个具有所需特性的克隆（pH7.4 时低结合；pH6.0 时高结合）。其中一种有条件活性的抗 EpCAM 变体被人源化。将一组 CAB 抗 CD3 scFv 片段融合到人源化克隆轻链的 C 末端，以构建与 EpCAM 和 CD3 有条件结合的抗 EpCAM × CD3 双特异性抗体文库。此处详细描述了其中一种抗EpCAM × CD3双特异性抗体克隆，克隆BF-588-DualCAB(CAB在EpCAM和CD3结合域均有功能)，并将其与克隆BF-588-MonoCAB(CAB仅在CD3结合域有功能)和克隆BF-588-WT(无CAB功能)进行了比较。
pH条件性激活双抗的体外表征
通过夹心ELISA测定不同pH下重组人EpCAM和人CD3的结合亲和力。BF-588-MonoCAB 和 BF-588-DualCAB 在 pH6.0 下均表现出与人 EpCAM 和人 CD3 的强烈结合。当测定中的 pH 值增加时，结合活性降低，并且在 pH7.4 时观察到很少的结合信号（图1 b－ｄ）。BF-588-DualCAB 的 EC 50在 pH6.0 时为 1.52 nM，在 pH7.4 时增加约 6 倍至 9.09 nM。
克隆 BF-588-DualCAB 的结合动力学通过 SPR 测定（图2ａ－ｂ）。克隆BF-588-Dual-CAB对人EpCAM的解离常数(KD)在pH6.0时为1.3nM，在pH6.5时为1.22nM，在pH7.4时为6.73nM。对于人 CD3ε/δ，pH6.0 时的亲和力测定为8.1 nM，pH6.5 时为 9.1 nM，pH7.4 时为 35 nM（图2 b）。除了 KD的变化之外，还观察到最大 SPR 信号从 pH6.0 到 pH7.4 急剧下降（对于人类 EpCAM，从约 100 个共振单位 [RU] 到约 25 RU，人类 CD3ε/δ 从 ~ 100 RU 到 ~ 10 RU ，这是CAB的特征。这种信号下降是由传感器表面反应配体的可逆可用性的变化引起的。反应性配体的可用性是由蛋白质与 PaCS 分子（即碳酸氢根离子）的相互作用引起的，PaCS 分子以浓度依赖性方式阻断BF-588-DualCAB的结合。
图 2.克隆 BF-588-DualCAB 在 pH6.0（上）、pH6.5（中）和 pH7.4（下）下与人 EpCAM（左）或人 CD3（右）的结合动力学。
靶点依赖性 T 细胞活性
使用 T 细胞激活生物测定研究了 BF-588-DualCAB 在体外激活 TCR 信号传导和诱导 T 细胞激活的能力。BF-588-DualCAB 参与 TCR/CD3 复合物并以 pH 依赖性方式激活报告细胞（图3 a）。在 TME (pH6.0) 的条件下，与正常生理碱性条件相比，BF-588-MonoCAB 和 BF-588-DualCAB 诱导 Jurkat 报告细胞活化的能力强约 4-6 倍条件（≥pH7.4）。在 TME 条件下，BF-588-DualCAB 抗体通过 TCR/CD3 复合物针对 HCT116 癌细胞诱导报告细胞激活的效力与 BF-588-WT 相似（图3 b）。在生理条件下 (pH7.4)，观察到 BF-588-DualCAB 的效力显着降低，EC50值在 pH7.4 时为 342.5 pM，而在 pH6.0 时为 76.54 pM。些结果表明，BF-588-MonoCAB 和 BF-588-DuaCAB在生理 pH 下通过 TCR/CD3 复合物诱导报告细胞活化的效力较低。
图 3.a-b.BF-588-DualCAB 的体外功能表征。
BF-588-Dual-CAB 介导 T 细胞介导的 EpCAM 表达细胞的细胞毒性
使用 CD3 介导的外周血单核细胞 (PBMC) 杀伤靶细胞，进一步表征 BF-588-DualCAB 的功能活性，并与 BF-588-WT 进行比较。将人PBMC与HCT116细胞和不同浓度的BF-588-DualCAB共培养80小时。使用 xCELLigence 实时细胞分析技术测定细胞生长。使用以下方程确定细胞毒性：
结果表明，BF-588-DualCAB在肿瘤环境（酸性 pH，pH6.5）中更有效地诱导人 PBMC（huPBMC）介导的 HCT116 细胞细胞毒性，而在正常生理碱性 pH（pH7.4）下活性较低（图3 c-d）。在生理pH（pH7.4）下，BF-588-WT更能有效促进人PBMC杀伤癌细胞。BF-588-DualCAB 在 TME pH (pH6.5) 中的 EC50为0.24 pM，在 pH7.4 时为2.2 pM(200 倍以上)。BF-588-WT 在 TME pH (pH6.5) 中的 EC50为0.06 pM，在 pH7.4 时为0.01 pM。
图 3.c-d.BF-588-DualCAB 的体外功能表征。
BF-588-DualCAB 抑制体内肿瘤生长
在 NOG 小鼠中评估了 EpCAM × CD3 双特异性抗体的抗肿瘤活性。小鼠静脉注射 BF-588-WT、BF-588-MonoCAB、BF-588-DualCAB 和 Isotype × WT CD3 双特异性抗体，剂量为 0.5-1 mg/kg (mpk)，每周两次，持续四个星期。当肿瘤体积约为130mm3时开始治疗。所有抗体均完全根除体内已形成的肿瘤（p ≤ 0.001；Dunnett 检验）（图4 a-c，HCT116）。用 BF-588-DualCAB 治疗小鼠可显着抑制肿瘤生长，给药后第 27 天的 TGI 为 106.8% (BT474细胞)（图4 d).
图 4. EpCAM T细胞接合器的体内功效。
BF-588-DualCAB 显示出体内安全性
EpCAM × CD3 双特异性抗体的安全性在食蟹猴的单剂量和重复剂量毒性研究中进行了评估。在单剂量毒性研究中，猴子（2只/组，1只雄性和1只雌性）以静脉注射(0.05 mpk) BF-588-WT；BF-588-MonoCAB（0.05、0.125、0.25、0.5 mpk）和 BF-588-DualCAB（0.05、0.5、2.5 mpk）。EpCAM × CD3 双特异性抗体相关毒性的总结见图5。对动物的耐受性和药理活性的评估是基于临床观察、定性食物消耗、体重、生命体征以及实验完成后的临床和解剖病理学。收集血样，使用流式细胞术进行细胞因子分析和免疫表型分析。
图 5.EpCAM x CD3 双特异性抗体在食蟹猴中的细胞因子释放和耐受性剂量。
还在食蟹猴中进行了一项重复剂量毒性研究，以评估 BF-588-DualCAB 的安全性以及每周一次给药一个月（总共五剂）后相关的全身暴露。BF-588-DualCAB 作为静脉注射给药。以0（对照）、0.5、1.5和5mg/kg/周注射给雄性和雌性猴子（6只动物/组，3只雄性和3只雌性）。恢复组动物（4只动物/组，2只雄性和2只雌性；4周恢复期）被包括在载体对照组和高剂量组中。BF-588-DualCAB 在最高测试剂量（5 毫克/公斤/周）下耐受性良好，没有死亡或发病情况。没有观察到 BF-588-DualCAB 相关的临床体征，并且在 4 周恢复期结束时没有观察到宏观或微观变化（图5 b）。总 T 细胞、辅助 T 细胞和细胞毒性 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、活化 CD69+T 细胞、Ki-67+中未发现 BF-588-DualCAB 相关变化。
单剂量和重复剂量毒理学研究的综合数据表明，与 BF-588-WT (MTD ≤0.05 mpk) 相比，BF-588-DualCAB (MTD ≥5 mpk) 的耐受性提高了 ≥ 100 倍（图5 c）。这种协同效应证明了 CAB 技术的多功能性和提高治疗指数的潜力。
pH激活抗体在体内的药代动力学
EpCAM x CD3 双特异性抗体在食蟹猴（2 只动物/组）中的药代动力学 (PK) 曲线在单次静脉注射后测定。BF-588-WT 剂量为 0.05 mpk；BF-588-MonoCAB 为 0.05、0.125 和 0.25 mpk，BF-588-DualCAB 为 0.05、0.5 和 2.5 mpk。来自非房室的 Cmax、 AUClast、 AUCinf,t1/2和 Tmax的PK 数据分析见（表 1）。
在接受相同剂量的相同测试组的雄性和雌性猴子之间没有观察到暴露的显着差异。雄性和雌性猴的 BF-588-WT 半衰期值分别为14.8 和 17.4 小时。在不同剂量水平下，BF-588-MonoCAB 半衰期为5.7-18.6 小时，BF-588-DualCAB 半衰期为29.6 至 42.2 小时。在 5 倍和 50 倍剂量范围内（BF-588-MonoCAB 为 0.05 至 0.25 mpk，BF-588-DualCAB 为 0.05 至 2.5 mpk），暴露于 BF-588-MonoCAB 和 BF-588-DualCAB Cmax和 AUClast通常以剂量成比例的方式增加（表 1）。
每周静脉注射后还测定了 BF-588-DualCAB 在食蟹猴中的 PK 曲线。第 1、8、15、22 和 29 天的剂量为 0.5、1 和 5 mpk。
首次给药或重复给药后，雄性和雌性食蟹猴之间的 BF-588-DualCAB 血清 PK 暴露无显着差异。第一次给药和四次重复给药后，BF-588-DualCAB 的 PK 暴露（Cmax和 AUC）以剂量依赖方式增加。BF-588-DualCAB 的线性 PK 特征也通过在 10 倍剂量范围内相似的全身清除率（~1 mL/h/kg）得到证明。对于 0.5、1.5、1.5和 5 mpk剂量的 BF-588-DualCAB，平均终末期 t1/2为首次给药后 53.3、50.7 和 54.9 小时，以及第 22 天重复给药后 51.6、145.0 和 81.9 小时。
食蟹猴中抗 BF-588-DualCAB 抗体 (ADA) 的发生率非常低。在 22 只接受该抗体的动物中，1.5mg/kg 组中的一只雄性猴子和 5mg/kg 组中的一只雌性猴子先前就存在 ADA，并且在整个研究过程中保持阳性。且食蟹猴中 BF-588-DualCAB 的总体全身暴露似乎并未始终受到 ADA 存在的影响。
TCE 是非常有效的分子，可以在没有 MHC 限制的情况下重新定向 T 细胞的细胞毒活性，并且是一种新兴的新型癌症疗法。TCE 旨在通过常见的信号分子（例如 CD3）招募 T 细胞来对抗带有频繁表达的肿瘤相关抗原 (TAA) 的肿瘤细胞。迄今为止，已有 12 个TCE获得批准；9 个用于靶向 BCMA、CD19、CD20 或 GPCR5D 的血液癌症，只有 3 个用于治疗靶向 EpCAM、gp100 和 DLL3 的实体瘤。针对实体瘤的 TCE 需要更高的外周水平才能在实体瘤组织内达到有效浓度，这可能导致严重的脱靶毒性。由于 TCE 可以识别非常低水平的 TAA，因此观察到正常组织中表达的 TAA 的靶向、非肿瘤毒性并不罕见。这阻碍了使用 CD3 导向的 TCE 来针对靶点（例如在正常组织中广泛表达的 EpCAM）开发双特异性抗体。
文献中已经描述了多种双特异性抗体形式。从 25 kDa（纳米抗体）到 300 kDa（连接 IgG）不等，通常可分为异二聚体和同二聚体分子。这里选择使用基于 IgG1 主链（针对 TAA）和融合到轻链 C 末端的 scFv 结构域以与 CD3 结合的同源二聚体形式。Fc 的存在允许使用蛋白 A 作为初始步骤纯化双特异性抗体，类似于标准 IgG 分子。在轻链 C 末端添加 CAB-CD3 结合结构域可以将任何抗体轻松转化为 MonoCAB（CD3 结合结构域处的 CAB 功能）TCE，无需额外的工程，从而创建了快速生成的平台MonoCAB TCE 针对任何肿瘤靶点。
在本文中，这些分子的免疫毒性和耐受性在食蟹猴的单剂量毒性研究中进行了测试。正如预期的那样，非 CAB 克隆 BF-588-WT 被证明具有很强的毒性，并且在 0.05 mpk 时不耐受（仅测试剂量）。细胞因子水平在给药后六小时内急剧增加，并对动物实施安乐死。BF-588-DualCAB 进行了高达 2.5 mpk 的测试，随后在高达 5 mpk 的重复剂量研究中进行了测试。尽管 BF-588-DualCAB 具有与非 CAB 和 MonoCAB 克隆相似的最小有效剂量激活 T 细胞和消除表达 EpCAM 的靶细胞的强大能力，但其免疫毒性极低。细胞因子水平轻微升高至 2.5 mpk (IL-6) 或略高于基线（IL-2 和 MCP-1）。在重复剂量研究中，动物接受 BF-588-DualCAB 剂量高达 5 mg/kg/周，持续 4 周，没有死亡或发病，没有观察到宏观或微观变化，也没有观察到细胞因子相关的 AE，这表明BF-588-DualCAB 的最大耐受剂量大于 5 mpk。
总之，数据表明，通过使用条件活性 CD3 结合域与非 CAB EpCAM 结合域组合，EpCAM 特异性 TCE 的耐受性提高了五倍以上。BioAtla的这款协同作用的DualCAB TCE（命名为 BA3182）启动了一项 1 期临床试验，以评估这种候选治疗药物作为泛癌疗法的潜力。
参考：10.1080/19420862.2024.2322562
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