首款IDH1/2双重抑制剂Vorasidenib 的分子设计与血脑屏障优化|二聚体|分子设计|变构|复合物|活性|细胞|蛋白

2024年8月6日，美国FDA批准施维雅（Servier）公司口服IDH1/IDH2双重抑制剂vorasidenib（商品名Voranigo）上市，用于12岁及以上伴有易感IDH1或IDH2突变的2级少突胶质细胞瘤或星形细胞瘤儿童和成人患者，这些患者此前接受过手术包括活检、次全切或全切。Vorasidenib是一款高活性、口服、脑穿透IDH1/IDH2双靶点抑制剂，可抑制突变的IDH1/2蛋白，该产品由施维雅在2020年收购Agios所得。

Vorasidenib(又名AG-881)研发之前之前，公开的变构抑制剂仅有对mIDH1或mIDH2单靶点抑制剂，有容易发生突变耐药的风险。这两款抑制剂mIDH1(Ivosidenib)和mIDH2(Enasidenib)具有不同的变构抑制袋，而且都不具有脑渗透性，仅适用于IDH突变的白血病患者。前期已上市的两款IDH抑制剂设计参见下文:

靶向治疗IDH1的药物研发回顾（一）-Ivosidenib

靶向治疗IDH2的药物研发回顾（二）-Enasidenib |药物研发中酶动力学分析

此外，IDH1/2突变发生在大约80%的低级别胶质瘤（LGG）患者中。需开发一款针对突变IDH1和IDH2酶，可口服、双靶点、脑渗透抑制剂，以弥补未满足的临床需求。

AG-881于2015年开展临床I期试验NCT02481154（实体瘤，主要是胶质瘤，2018 ASCO Annual Meeting会议披露初步临床结果，2021于CCR中披露I期完整结果，10.1158/1078-0432.CCR-21-0611）和NCT02492737（血液肿瘤， 2018完成，于23年才披露临床结果The American Journal of Hematology,，耐受剂量高达 600 mg QD。在未接受过 mIDH 抑制剂治疗的患者中观察到 2-HG 抑制和临床活性证据；然而，接受过 mIDH 抑制剂治疗的 AML 患者的需次优剂量疗效特征，限制了vorasidenib 对防止亚型转换的双突变酶抑制剂疗效的评估；因此，没有继续开发 vorasidenib 用于 AML 的药物。基于 vorasidenib 的良好的脑渗透活性，其开发重点是 mIDH 神经胶质瘤患者）。

vorasidenib的III期胶质瘤临床试验于去年公布，其无进展生存率中位数，27.7个月对11.1个月，表现相当优异。具体报道参见:

N Engl J Med|Vorasidenib 在 IDH1 或 IDH2 突变型低级别胶质瘤中的III期临床研究

2020年ACS Medicinal Chemistry Letter中详细披露了，双抑制剂AG-881的分子、血脑屏障优化过程。

备注: 1. 异源二聚体酶mIDH1-R132H/ IDH1-WT和同源二聚体酶mIDH2-R140Q被用于主要生化效力评估，常规使用患者来源的神经球TS603 IDH1-R132H胶质瘤球细胞系和U87MG pLVX IDH2-R140Q工程细胞系进行细胞功能分析。通过LC-MS定量48 h时培养基中的2-HG来评估基于细胞的2-HG抑制作用。2. 拓扑极性表面积(tPSA)减小且氢键供体/受体较少的mIDH抑制剂类似物将提高穿过血脑屏障的能力。

在发现mIDH2抑制剂enasidenib(有三个氢键供体)的研究过程中，发现具有两个氢键供体的相关三嗪化合物(AGI- 12026)且对mIDH2和mIDH1酶均有良好的抑制作用，并表现出良好的脑渗透性(表1)。enasidenib和AGI-12026均对IDH1-R132H同型二聚体有部分抑制作用(表1)，因为已知变构调节剂可诱导酶活性位点发生完全和中间结构变化，从而产生不同程度的疗效。为了评估初步的结构-活性关系(SAR)，研究者筛选了可获得的所有三嗪类化合物，以识别潜在的mIDH1和mIDH2的脑穿透小分子抑制剂。

在小鼠药代动力学研究中，一些三嗪类化合物显示出对mIDH1-R132H和mIDH2-R140Q酶的良好抑制活性和相对于血浆浓度的大量脑暴露。一种化合物，AGI-15056，有效地抑制了这两种酶，脑/血浆比值为1.5(表1)。此外，AGI-15056有效地抑制了异源二聚体IDH1-WT/ IDH1-R132H酶，并在神经球TS603 IDH1-R132H和U87MG IDH2-R140Q突变细胞实验中显示出优异的效力(表3)。

AGI-15056的化学结构特征是在三嗪的6位有一个芳基环，在骨架的2位和4位有两个脂肪族胺。其他具有双重mIDH1/2抑制活性的化合物共享这体骨架，因此合成优化工作集中在这一亚类骨架。

AGI-15056(R, R)的另外两种异构体，化合物1(S, R)和2(S, S)在所有生化和细胞分析中显示出略低的效力。因此，(R, R)异构体在SAR研究中得到了重视。对所有相关异构体的关键类似物进行了阶段性合成，并保持了(R, R)-异构体具有优异效力。

在2.66 Å分辨率下确定了AGI-15056与mIDH1-R132H (IDH1-R132H·NADPH·AGI-15056)复合物的共晶体结构，以实现基于结构的设计。AGI-15056与IDH1- R132H保守的二聚体界面的别构四螺旋中心结合，并以一种假对称姿态(pseudosymmetric pose)的构象被捕获，类似于IDH2-R140Q结合enasidenib晶体结构(图1)。

图1. IDH1-R132H·NADPH·AGI-15056复合物

与enasidenib/IDH2-R140Q复合物一样，这里的mIDH1蛋白处于开放非活性状态。三嗪抑制剂结合口袋周围有4个螺旋(α9、α10、α9′、α10′)和2个环(L1、L1′)，Y272−D273相互作用对覆盖末端。氨基三嗪核心通过与指向囊泡内部的两个Q277残基侧链的氢键相互作用，而大多数抑制剂被疏水残基(V121、W124、I251、V255、M259和W267)包围，并通过范德华接触相互作用。在结合位点的另一个亲水残基(S280)不与抑制剂相互作用。AGI-15056的三氟甲基与D273氧通过碳-氟-氧键(tetrel σ键)相互作用，交替的姿势在对称口袋的两侧展示了这种相互作用。AGI-15056与enasidenib/IDH2-R140Q具有相似的结合口袋结构，以及这两种系统的共同特异性相互作用，解释了观察到的AGI-15056对mIDH1和mIDH2酶的亲和力。结合位点的大部分残基在mIDH1和mIDH2之间保守。结构比较表明，enasidenib与mIDH2特异性疏水残基对V297、L298、I319和L320相互作用(与mIDH1的A258、M259、S280和V281相比)，这可能解释了其选择性。抑制剂结合的对称性，大部分疏水的口袋环境，以及在特定相互作用中观察到的不同点是研究人员对SAR探索的中心主题。

利用这些对抑制剂-蛋白相互作用和结合位点特征的认识，研发人员合成了几种化合物来检测三嗪系列的SAR。

首先，作者检测了C-6位置上的R1取代以确定最佳取代基(表2)。去除CF3取代基导致效力的极大损失(3)，CF3基团被各种极性取代基(4、5、6和7)取代也是如此。只有用氯取代该基团(8)才能保持效力在5倍水平内。去除氯吡啶中的氮导致其效价进一步下降(9)。在R1环的5位(10)中添加第二个氮会使IC50变弱，而添加双环系统(11)或饱和R1环(12)则会完全阻止与mIDH1的结合。

其次，作者研究了R2, R2的对称取代，将CF3 -吡啶保留在R1中(表3)。从AGI-15056类似物(13)中去除甲基导致酶效性的损失，但不会导致细胞效用的损失。二氟环丁基(14)和二氟环戊基(15)类似物对mIDH1和mIDH2都有酶活和细胞内纳摩尔级的效力。二氟环己基取代(16)导致酶活性降低，但细胞活性良好。叔丁基取代(17)导致活性较弱。这些结果与共晶体结构的见解一致，表明这是亲脂性驱动结合位点。

最后，作为唯一表现出良好效价的R1取代基是2- Cl -吡啶(8,表2)，利用CF3 -吡啶体系中最优的R2, R2’，以该取代基合成了一系列类似物(表4)。化合物18表现出良好的酶活性和细胞活性，尤其是在TS603细胞实验中。化合物19在所有测定中效力较低，化合物20和21(具有相似效力。三氟- 2-甲基丙烷取代(22)在TS603细胞实验中显示出良好的抑制作用，这导致了对其立体异构体的研究。在异源二聚体mIDH1酶分析中，所有三种异构体(23、24和vorasidenib)均具有纳摩尔的效力，而vorasidenib (R, R异构体)在细胞分析中具有略好的效力，这提示生化分析条件未能完全捕获转化为较好的细胞效力的停留时间。在大鼠药代动力学研究中，vorasidenib和化合物24的脑-血浆比值分别为0.65和0.46。在这一点上，vorasidenib被选择用于进一步分析，以评估其作为治疗胶质瘤临床候选药物的潜力。

在小鼠中测试了这些关键分子的脑穿透能力。脑-血浆比值在0.65 ~ 2.5之间的所有化合物的tPSA值均在73 ~ 86 Å2。这些值属于传统上接受的脑穿透分子的指导方案。然而，enasidenib的脑-血浆比值较低(0.14)，和tPSA同样较低(106 Å2)。enasidenib有3个氢键供体，而其他所有分子均有2个氢键供体，这表明分子中最多有2个氢键供体才能脑穿透，这可能是由于tPSA总体较低和正辛醇与水之间的分配系数的对数(logP)较高。所有测试的化合物均具有clogP > 3，反映了mIDH1蛋白的非常疏水的结合位点。

由于vorasidenib是第一个被报道的双mIDH1/2抑制剂，因此作者确定了vorasidenib与IDH1-R132H和IDH2-R140Q同源二聚体的NADPH结合形式的复合物共晶体结构，分辨率分别为2.1和1.99 Å(6VEI, 6VFZ)。这两组晶体结构非常相似，差别很小。Vorasidenib结合IDH1-R132H和IDH2-R140Q在两个单体界面上由两个单体的两条螺旋形成的同一个变构口袋中，以对称的方式(图2)。同16年报道的结果一样，并且在enasidenib中也有描述，如之前在AGI-15056中所讨论的。

图2. Vorasidenib与IDH1-R132H和IDH2-R140Q的复合物

这三种晶体结构表明两种酶都处于开放抑制构象状态。亲水性和疏水性相互作用驱动vorasidenib与mIDH1和mIDH2蛋白的亲和力。电子密度分析表明，对于每种IDH1-R132H二聚体，vorasidenib分子有一种构象，其具体相互作用包括Q277侧链与任意一侧的氨基三嗪核心形成氢键(图2A)。在vorasidenib的氯吡啶部分的氯原子与作为盖帽残基一部分的D273的羰基之间存在卤素键。另外三个氟-氧键存在于一侧的脂肪族CF3和Q277的羰基氧之间，V255的主链羰基和相同的CF3之间，以及对称口袋另一侧的另一个CF3和V255'的主链羰基之间。Vorasidenib还与残基W124、M259、V255、V276和W267的侧链发生多次范德华接触。

进一步研究表明Vorasidenib在体内具有优异的药代特征及高效抑制2-HG生成的药效(图 3-4)

图3：Vorasidenib在血浆、脑和脑脊液中的浓度(大鼠单次口服剂量3mg /kg; N = 3)。

图4.在原位III级mIDH1胶质瘤模型(TS603)中，Vorasidenib (AG-881)抑制了2-HG水平。剂量:50 mg/kg口服，每天两次，连续4天。灰色区表示剂量间隔;24小时时间点被纳入评估在最后一次给药后2-HG抑制在脑肿瘤中持续的时间。将“正常”脑(所有动物大脑左侧半球)的2-HG AUC0 ~ 12h与脑肿瘤AUC0 ~ 12h相减后，建立了%2-HG抑制模型。灰色虚线表示未治疗动物脑肿瘤中的2-HG浓度。

此外，AG-881的共结晶结构也被北京大学基础医学院云彩红教授团队报道（2018年），也从另一方面验证了AG-881的作用机制。

解析了IDH1-R132H/NADPH/AG-881(6ADG)和IDH2-R140Q/NADPH/AG-881(6ADI)复合物的晶体结构，并获得了 AG-881 对 IDH1 的 IC50 值-R132H 和 IDH2-R140Q 同源二聚体在不同的预孵育时间后。数据表明，AG-881 在相同的变构口袋中结合 IDH1-R132H [快结合]和 IDH2-R140Q[慢结合]，这两种蛋白质口袋中的细微差异可能导致 AG-881 对它们的抑制动力学显著不同。