肿瘤转移的连续步骤包括肿瘤细胞从原发部位脱落、侵入周围组织、在血管系统中内渗和存活，以及外渗到远端部位并产生继发性肿瘤。循环肿瘤细胞（CTCs）是从原发肿瘤中脱落并进入血液循环系统中的肿瘤细胞，CTCs 会经历多种环境压力，例如失巢凋亡、缺氧、剪切应力、氧化应激和免疫监视。临床研究报道，血液中 CTCs 的含量与癌症患者的生存率高度相关。
免疫系统在肿瘤转移的每一步都起着清除肿瘤细胞的重要作用。由于 CTCs 在血液中的半衰期较短（1-2.4 小时），因此通过免疫监测有效杀死这些肿瘤细胞需要直接快速的识别和细胞毒性。自然杀伤细胞（NK）细胞是先天免疫系统的重要组成部分，是 CTCs 的主要消除剂，可以通过一系列生殖性编码的激活和抑制受体快速识别和杀死肿瘤细胞。
NK 细胞表面的 NKG2D 是一种重要的免疫激活型受体，它能够识别多种配体分子，这些配体分子在免疫系统中扮演着关键角色。以往研究揭示了生物机械力如何通过选择性机械调节配体的构象变化，从而赋予 NKG2D 识别不同配体的能力，这表明 NKG2D 可能是一种潜在的机械传感器。
在血管系统中，CTCs 同时暴露于 NK 细胞和流体剪切力（FSS）。然而，它们对 CTCs 存活的协同作用仍不清楚，特别是FSS 是否能影响 NK 细胞对 CTCs 的细胞毒性。鉴于此，香港理工大学生物医学工程系的研究团队调查了 FSS 下 NK 细胞对 CTCs 细胞毒性的影响，剖析了剪切依赖性细胞毒性的潜在机制，包括 NK 分泌的细胞因子和颗粒酶B，还测试了 NKG2D 响应 FSS 的机械敏感性。研究成果发表于 APL Bioengineering 期刊题为“Fluid shear stress enhances natural killer cell's cytotoxicity toward circulating tumor cells through NKG2D-mediated mechanosensing”。
首先，为了研究 FSS 对 NK 细胞毒性的影响，使用悬浮乳腺癌细胞模拟 CTCs，将其暴露于 FSS（1 和 5 dyn/cm2）下。无论是否与 NK 细胞共培养，肿瘤细胞都表现出剪切依赖性死亡反应。重要的是，NK 细胞和 FSS 下肿瘤细胞的裂解率远高于 NK 细胞或 FSS 诱导的死亡，特别是在 5 dyn/cm2 下。这表明 FSS 和 NK 细胞之间存在相互作用。同样，在肿瘤细胞中观察到剪切依赖性 caspase-3 激活和 caspase 活性增加，这可能部分解释了剪切依赖性裂解反应。这些发现表明，FSS 可以促进 NK 细胞对 CTCs 的细胞毒性。
NK 细胞杀死 CTCs 的主要方式是与靶细胞作用形成偶联物，通过免疫突触释放穿孔素在细胞膜上形成跨膜通道，并递送主要效应酶颗粒酶B。为了阐明 FSS 如何增强 NK 细胞的细胞毒性，测试了 FSS 对偶联物形成的影响。结果表明，肿瘤细胞和 NK 细胞之间的偶联物形成随着 FSS 的增加而减少（图1 a），这可能是由剪切介导的干扰引起的。然而，FSS 越高，形成的偶联物中凋亡细胞越多（图1 b）。此外，CD107a（NK 细胞活性标志物）的表达在 5 dyn/cm2 FSS 时显著增加（图1 c），表明剪切诱导 NK 细胞的激活。
NK 细胞的微管组织中心（MTOC）负责裂解颗粒的定向递送。MTOC 和突触之间的距离随着 FSS 的增加而减小（图1 d），表明 MTOC 极化依赖于剪切力。在 5 dyn/cm2 FSS 下，MTOC 更接近突触（图1 d），表明偶联的 NK 细胞被激活。因此，在 5 dyn/cm2 FSS 下，更多的颗粒酶B 被递送到偶联的人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞中（图1 e），这可能解释了 NK 细胞对 CTCs 的细胞毒性增强。
另外 ，NK 细胞也可以通过分泌细胞因子（包括 TNF-α、IFN-γ）以及通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导肿瘤细胞死亡。进一步的机制研究发现，不同水平的 FSS 下有和没有肿瘤细胞时，TNF-α 的分泌没有显著差异。有趣的是，与 0 dyn/cm2 相比，IFN-γ 在 1 和 5 dyn/cm2 FSS 时下降。这表明 FSS 不促进 TNF-α 和 IFN-γ 的分泌。此外，还测试了这些细胞因子在 FSS 下的细胞毒作用，发现有或没有 TNF-α 和 IFN-γ 时细胞凋亡没有差异。在 FSS 下，从悬浮肿瘤细胞和 NK 细胞的共培养中收集条件培养基，发现在 1 和 5 dyn/cm2 下没有细胞裂解的净增量，表明 NK 细胞分泌的细胞因子可能无助于剪切诱导的 NK 细胞毒性增加。
上述结果表明，FSS 破坏 NK 和肿瘤细胞之间的偶联物形成，同时促进 NK 细胞活化和颗粒酶B 在偶联物到靶细胞的递送，这可能会增强 NK 细胞的细胞毒性。
NKG2D 拥有多种配体，包括人类 MHC-I 类链相关分子（MICA 和 MICB）和人类 UL16 结合蛋白（ULBPs）。接下来，为了测试 NKG2D 在剪切诱导的 NK 细胞毒性中的作用，探讨了 FSS 对 NKG2D 及其配体表达的影响。有趣的是，剪切处理对 NK 细胞中 NKG2D 的 mRNA 和蛋白质水平（图2 a、b）以及 MDA-MB-231 细胞上的配体（图2 c）没有显著影响。
进一步敲低 NK 细胞中的 NKG2D，发现沉默 NKG2D 在 5 dyn/cm2 FSS 下显著降低了细胞毒性增量（图2 d）。在 FSS 下，所有肿瘤细胞和偶联细胞中颗粒酶B 的数量显著升高，而 NKG2D 的抑制则减弱了这种效应（图2 e、f）。
由于与靶细胞上的 MICA 连接后，PI3K 和 VAV1-Grb2 将在衔接蛋白 DAP10 和 Gab2 的帮助下被募集到 NKG2D 的细胞内结构域，转导激活信号，然后促进颗粒酶B 递送到靶细胞中。因此实验检测了 FSS 下 PI3K 和 Gab2 信号的激活，发现与静态条件相比，5 dyn/cm2 FSS 促进了突触区域内 PI3K 和 Gab2 的磷酸化水平（图2 g、h），抑制其表达则减少了剪切诱导的颗粒酶B 到肿瘤细胞中的递送。这些结果表明，FSS 可能通过 NKG2D 介导的颗粒酶B 促进 NK 细胞的细胞毒性。
最后，研究探讨了 NKG2D 是否能够直接感知和响应 FSS。随着 FSS 的增加，粘附的 NK 细胞在细胞膜上表现出 CD107a 表达升高（图3 a），这表明 NK 细胞的细胞毒性增强。然而，FSS 不能促进粘附在整合素 LFA-1 配体 ICAM-1 包被底物的 NK 细胞中的 CD107a 表达。这些发现表明，剪切诱导的 NK 细胞激活可能是通过直接的 NKG2D-MICA 力感应介导的。在与 MICA 相互作用时，NKG2D 胞内结构域的接头蛋白 DAP10 募集 Grb2-VAV1 和 PI3K 以促进免疫突触形成和 NK 细胞活化。
酪氨酸蛋白激酶 Lck 可磷酸化 VAV1 和 PI3K 以启动下游信号传导。荧光共振能量转移（FRET）测量 Lck 活性发现，FSS 可以在 NK 细胞与靶细胞偶联后促进 Lck 活性。沉默 NKG2D 可减少 FRET 比率的下降，并将 Lck 活性恢复到对照水平（图3 b）。FSS 还促进了免疫突触内磷酸化 VAV1 的积累，沉默 NKG2D 完全减弱了 VAV1（图3 c）。此外，在 FSS 下，PI3K 下游 Akt 的磷酸化显著增强，敲低 NKG2D 可以抑制这种效应（图3 d）。FSS 还可以促进与靶细胞结合后 NK 细胞的 MTOC 极化（图3 d），沉默 NKG2D 则减弱这种效应（图3 e）。这些结果表明，激活受体 NKG2D 在与 MICA 结合后可以通过激活下游 Lck/Grb2/VAV1/PI3K 信号来直接感知和响应 FSS，这可能促进 NK 细胞的细胞毒性。
总之，该研究报道了 FSS 以剪切依赖性方式增强 NK 细胞对 CTCs 的细胞毒性。肿瘤细胞死亡的增加归因于剪切诱导的 NK 细胞活化，然后将更多的颗粒酶B 输送到 CTCs 中以诱导细胞凋亡，而分泌的细胞因子和死亡配体的作用是非必要的。重要的是，当与配体 MICA 结合时，NKG2D 可以直接感应 FSS 以促进 NK 细胞活化和细胞毒性。沉默 NKG2D 消除了 FSS 介导的 NK 细胞活化、颗粒酶B 递送和 CTCs 的增量死亡。这些发现揭示了一种 NK 细胞对 CTC 的机械调控杀伤机制，这可能为基于 NK 细胞的免疫治疗提供一种新的机械靶向策略。
参考文献：Hu B, Xin Y, Hu G, Li K, Tan Y. Fluid shear stress enhances natural killer cell's cytotoxicity toward circulating tumor cells through NKG2D-mediated mechanosensing. APL Bioeng. 2023 Aug 11;7(3):036108. doi: 10.1063/5.0156628. PMID: 37575881; PMCID: PMC10423075.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37575881/或点击阅读原文
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