引言
小核酸药物是目前发展最为迅速的基因疗法之一，作用机理是直接靶向致病靶基因或RNA片段，通常采用固相亚磷酰胺化学法来进行合成，一般是由12~30个核苷酸单链或双链组成的一类药物，通过直接靶向致病靶基因或作用于信使 RNA(mRNA) 来调控致病基因转录翻译，具有高特异性。
受限于合成效率以及原料质量，并不是所有的寡核苷酸都能合成完整的寡核苷酸链，合成得到的初产物会含有多种不同的杂质，其中最主要的杂质就是由于单个或多个寡核苷酸差异导致的失败序列（N-x/N+x）。这些N-x与N+x杂质的性质与目标产物非常接近，在分子大小、电荷和疏水性方面的差异通常很小，为纯化工艺带来很大的挑战，合成后必须应用高分辨率纯化技术，才能使目标分子与杂质分离。
所以寡核苷酸合成之后，如何选择合适的填料和纯化工艺对于产品质量和生产放大都非常重要。目前主流的纯化方式主要是阴离子交换层析、反相层析和疏水层析。由于核苷酸序列不同和粗品杂质含量的差异，可结合或选择其中一种或者两种方式进行纯化。
寡核苷酸药物的分类
寡核苷酸药物通常指由化学合成的12~30个核苷酸单链或双链组成的一类药物，主要包括反义寡核苷酸 （ASO) 、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、小激活RNA (saRNA)、信使RNA (mRNA)、RNA适配体(Aptamer)等。
寡核苷酸药物与蛋白类和小分子药物不同之处在于，寡核苷酸药物并非作用于蛋白，而是可以直接调控基因的表达，因此被认为是继小分子药物、蛋白药物之后的第三代创新药物。
寡核苷酸药物的合成方法
寡核苷酸的合成方法目前主要有液相合成、固相合成以及生物合成的方法。其中最主流的合成方法是采用固相合成法，利用自动化的设备通过固相亚磷酰胺化学法来进行合成。
Fig.1所示为合成用单体，主要由碱基、脱氧核糖、5'-DMT和3'端的2-氰乙基以及二异丙胺基组成，而RNA的亚磷酰胺单体中则需要对2'-OH进行保护，以防止在固相合成中2'-OH与5'-OH发生交叉反应，该保护基团一般为TBDMS。
此外，由于腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤和一些人工碱基存在伯氨基，因此也需要在单元中用适当的保护基团对其保护。
寡核苷酸的固相合成具体过程由4步循环组成：脱保护、 偶联、氧化和盖帽。在合成循环后，需要对中间产品使用氨水进行氨解反应，将寡核苷酸从固相载体上切割下来并进行基团的脱保护处理。
1.脱保护
使用干燥有机溶剂与酸液（二氯乙酸）除去核苷酸上的5'-DMT保护基团，暴露5'-OH，以供下一步偶联。
2.偶联
单体经过活化后被泵入合成柱，脱保护的5'-OH会与亚磷酰胺四唑活性中间体，形成新的磷氧键，在这一步核苷酸链得到延伸。
3.氧化
偶联反应生成的亚磷酯键，易被酸、碱水解，因此需要进行氧化或硫化操作，形成磷酸二酯（或硫代膦酸二酯）键。
4.加帽
为了防止这些5'的活跃基团与下一个循环加入的活化亚磷酰胺单体发生偶联反应，进而产生N-1杂质，需要对未参与偶联的5'-OH羟基加帽。
寡核苷酸药物的纯化工艺
受限于反应效率及原料纯度等，合成的产物中存在多种不同的杂质。主要表现为单个或多个寡核苷酸的差异（N-x/N+x），保护基团的保留，例如DMT+、3'+产物，以及嘌呤的脱除等。这些基团或者序列的改变会导致杂质分子与目标产物之间存在性质上的差异。主要表现为：
•磷酸基团（Phosphate group）：寡核苷酸所带静电荷取决于磷酸或修饰基团的数目、碱基的数目以及二级结构是否遮蔽带电基团。通常在变性条件（例pH12）打开氢键使结构展开并且碱基不带电（pH>pKa），以有效区分N-1杂质。
• DMT on/off：DMT是一个强疏水性基团，与反相层析/疏水层析产生相互作用。因此可以用于带有DMT的全长序列的分离。
•硫代（Thiolation）：当磷酸基团中的氧原子被硫原子取代时，带负电的基团极性增加，在大多数pH条件下与阴离子交换填料结合更强。
•甲基化（Methylation）：当氧原子被甲基取代时，疏水增强。
因此，在小核酸的纯化过程中可以利用上述性质差异进行分离，通常采用离子交换层析、疏水层析及反相层析并进行合理组合。
案例分享：BestPoly 15Q纯化寡核苷酸
阴离子层析是一种可以在水相条件下对寡核苷酸进行分离的层析方法，无需使用有机溶剂，因此无需考虑车间和设备的防爆。
博格隆BestPoly 15Q是一款聚苯乙烯-二乙烯基苯材质的强阴离子填料，平均粒径15μm，化学性质稳定、刚性强，可在高pH条件下操作，高pH可以避免单链自互补或者富含GC寡核苷酸聚集。本案例使用博格隆BestPoly 15Q对合成后的寡核苷酸进行纯化，最终纯度90%以上样品占比可达52%。
总结
小核酸药物作为一个新的生物制药技术平台，现在已进入成熟阶段，即将迎来快速发展。它已经展示出一些颠覆性技术的特质，尤其是可能会改变慢性病的治疗理念和策略。这一变化会带来单克隆抗体式的医药产业格局重构，今后十年、二十年都是核酸制药产业发展的一个重大窗口期。
对于寡核苷酸生产来说，最为重要的因素是寡核苷酸的合成及合成后的纯化，所以选择一款高效纯化填料十分重要。博格隆作为国内层析填料生产行业的龙头企业，也在不断推出适配市场需求的新产品，为客户提供更多样化的选择。
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参考资料
[1] Ramasamy T, Ruttala HB, Munusamy S, Chakraborty N, Kim JO. Nano drug delivery systems for antisense oligonucleotides (ASO) therapeutics [published correction appears in J Control Release. 2023 Feb;354:34]. J Control Release. 2022;352:861-878.
[2] Jamil Shanagar. Purification of a synthetic oligonucleotide by anion exchange chromatography: Method optimisation and scale-up. J. Biochem. Biophys. Methods 64 (2005) 216–225
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