小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，是大脑发育、体内平衡和神经系统疾病的关键参与者。小胶质细胞具有高度可塑性，并可根据位置和系统需求获得各种结构变化和转录表型。在可以驱动小胶质细胞走向有益表型的策略中，间充质干细胞（MSCs）是目前正在被研究作为影响成人和新生儿神经炎症性疾病的有吸引力的细胞疗法。MSCs 调节多种免疫细胞效应功能并减弱活性氧的产生，促进神经系统疾病临床前模型中脑组织功能的恢复，包括围产期脑损伤、创伤性脑损伤和神经退行性疾病。
具体来说，在 TBI 小鼠模型中，MSCs 的分泌蛋白组在体外和体内诱导促再生小胶质细胞标志物（Ym1和Arg1 mRNAs）的表达，促进其持续恢复。此外，当与 MSCs 共培养时，对炎性细胞因子有反应的小胶质细胞会释放细胞外囊泡（EVs），当注射到脱髓鞘小鼠模型中时，这些 EVs 会促进髓鞘病变部位的髓鞘修复。然而，MSCs 促进小胶质细胞向稳态/促再生功能转变的分子机制仍有待完全阐明。
最近，在意大利国家研究委员会神经科学研究所、米兰比可卡大学医学与外科系及英国诺丁汉特伦特大学科学与技术学院的一项联合研究中，通过使用大量转录组学方法，揭示了与人脐带间充质干细胞（h-MSCs）共培养诱导的活化小胶质细胞信号通路，首次阐释了细胞外基质（ECM）的重塑；还研究了 h-MSCs 对小胶质细胞在体外响应细胞因子的基本功能的影响，包括增殖、运动、吞噬作用和抗原呈递。研究成果发表在 CELLS 期刊题为“Human Umbilical Cord-Mesenchymal Stem Cells Promote Extracellular Matrix Remodeling in Microglia”。
为了表征 h-MSCs 对活化小胶质细胞（TNFα+ IFNγ+ IL-1β 刺激）的影响，首先通过 qPCR 量化了保护/免疫调节基因（Arg1 和 Socs3 mRNAs）、炎症基因 （Tnfα 、 Ptgs2、Nos2、Il1β 和 Il6 mRNAs）、稳态基因 Tmem119 和疾病相关小胶质细胞（DAM）基因 Clec7a mRNA 的表达。结果表明，在炎症条件下，单独培养的小胶质细胞上调了炎症基因Tnfα、Ptgs2、Nos2、Il6 mRNAs，免疫调节基因 Socs3 和激活标志物 Clec7a，而与 h-MSCs 共培养的小胶质细胞上调了 Arg1、Socs3 及Tmem119 mRNA 表达，并下调了 Clec7a mRNA。h-MSCs 对小胶质细胞炎症基因表达的影响很复杂，一些炎症基因下调，如 Tnfα 和 Ptgs2，而其他，如 Nos2、Il6 和 Il1β 呈现过表达（图1）。这些数据表明，尽管 h-MSCs 维持甚至上调了一些炎症特征，但在细胞因子的作用下，h-MSCs 诱导了小胶质细胞中保护性标志物的表达并部分抵消了炎症基因表达。
为了证实这些发现，在体外小胶质细胞培养物中量化了免疫调节标志物、炎症标志物和抗炎标志物的表达。数据表明，与从混合培养物中获得的小胶质细胞相比，h-MSCs 在体外小胶质细胞对炎症细胞因子的反应中更快、更有效地抑制炎症基因表达，这与在大脑环境中缺乏抑制信号的情况下，小胶质细胞在体外存活时间更长的反应性是一致的。
为了更深入地了解 h-MSCs 与活化的小胶质细胞共培养诱导的转录变化，接下来进行了大量 RNA-seq。在存在或不存在 h-MSCs 的情况下培养的活化小胶质细胞之间的差异基因表达分析显示，共有 1519 个显著失调的 mRNAs （711 个上调和 808 个下调）。在被 h-MSCs 高度上调的基因中，发现了保护/免疫调节基因 Arg1 和 Socs3，以及 Il1β 和血清淀粉样蛋白Saa3，这证实了上述通过 qPCR 分析观察到的结果。此外，还检测到编码 ECM 成分的蛋白及其调节因子的显著上调。相反，稳态基因 Cx3cr1 和脂蛋白脂酶（Lpl）mRNA 是下调最多的基因，这一发现与显示这些标记物在小胶质细胞激活时下调的研究数据一致。
对 DEGs 通路的进一步分析强调了小胶质细胞在积极修饰 ECM 和影响 ECM 依赖性神经元活动（如轴突导向）中的关键作用，表明 h-MSCs 处理的小胶质细胞可能参与 ECM 重塑和沉积。基因集富集分析（GSEA）显示，与活化的小胶质细胞相比，在 h-MSCs 处理的小胶质细胞中有10个基因组富集，表明 h-MSCs 显著改变了 ECM 基因表达。这些数据有力地支持了由小胶质细胞引起的 ECM 变化受 h-MSCs 直接调控的观点。
其中，最丰富的基因集是 NABA_CORE_MATRISOME，这是编码核心细胞外基质元件的基因集合，分析显示，其存在编码几种关键 ECM 成分的基因的存在，例如胶原蛋白亚型、层粘连蛋白1-2-4、玻连蛋白等。其他上调的 NABA 基因包括转谷氨酰胺酶 （Tgm1-2-4-6-7），它们通过细胞外交联活性在 ECM 稳定和抗降解中发挥重要作用。总的来说，观察到的 NABA 基因上调表明 ECM 沉积和稳定增加。
通路分析和 GSEA 还揭示了与单独培养的活化小胶质细胞相比，h-MSCs 处理的小胶质细胞中免疫调节细胞因子白细胞介素-4 和 -13 以及白细胞介素-10 的富集信号（图2 A、B）。此外，使用免疫过程负调控特异性基因集的进一步 GSEA 证实了参与免疫调节途径的基因的富集（图2 B），这与 h-MSCs 对小胶质细胞炎症反应的复杂作用一致（图1）。对关键小胶质细胞功能特异性基因集的 GSEA 证实了控制细胞周期的基因下调（图2 C），抗原呈递相关基因的下调（图2 C），但参与吞噬作用的基因表达无变化。相反，与单独培养的活化小胶质细胞相比，hMSCs 处理的小胶质细胞中与黏着斑、趋化因子活性、髓样细胞迁移和运动相关的基因显著富集（图2 C），表明 h-MSCs 处理提高了小胶质细胞在环境中的监测能力。
这些数据表明，增殖、抗原呈递和运动/迁移是受 h-MSCs 影响的关键小胶质细胞功能，此外还有 ECM 重塑和炎症反应的调节。
最后，为了探索 h-MSCs 诱导的基因表达变化如何影响小胶质细胞功能，分析单独培养或与 h-MSCs 一起培养的活化小胶质细胞中 ECM 沉积、细胞运动、增殖、吞噬作用和抗原呈递能力。
免疫荧光分析显示，与活化的小胶质细胞相比，h-MSCs 处理的小胶质细胞及其周围环境的 ECM 成分纤维连接蛋白染色增加（图3 A、B），细胞外交联剂 TG2 的免疫反应性也更强（图3 C、D），这表明暴露于 h-MSCs 的活化小胶质细胞中，TG2 酶活性和 ECM 重塑/稳定增加。
然后监测小胶质细胞的运动，分析显示，与单独培养的小胶质细胞相比，与 h-MSCs 培养的小胶质细胞的移动路径更长，速度更快，并且细胞褶皱形成增加（图3 E、F），这是积极迁移细胞的特征。增殖测定发现，活化的小胶质细胞中 EdU+ 增殖的小胶质细胞的百分比强烈降低，表明炎症刺激 LPS 强烈抑制小胶质细胞增殖，但 h-MSCs 培养并没有进一步降低，排除了 h-MSCs 对该细胞功能的主要影响。对吞噬的定量分析表明，单独培养或与 h-MSCs 共培养的活化小胶质细胞的吞噬能力与对照细胞的吞噬能力没有差异。
此外，还评估了主要组织相容性复合物II（MHCII）蛋白（小胶质细胞抗原呈递能力的指标）和 CLEC7a（活化反应小胶质细胞（ARMs）标志物）的表达。结果表明，与单独培养的对照小胶质细胞相比，对炎性细胞因子有反应的小胶质细胞的 MHCII 和 CLEC7a 免疫反应性增加，表明抗原呈递能力和细胞活化增强。然而，在与 h-MSCs 共培养的活化小胶质细胞中，MHCII 水平恢复到对照水平，CLEC7a 表达甚至低于对照水平，揭示了 MSCs 分泌蛋白组抑制免疫小胶质细胞功能的能力。
这些数据表明，h-MSCs 在炎症刺激下促进小胶质细胞中的 ECM 沉积和运动，但不会显著影响这些细胞的增殖和吞噬能力。此外，h-MSCs 可抵消炎性细胞因子诱导的 MHCII 和 CLEC7a 蛋白水平的增加。
总之，该研究通过体外共培养方法结合转录组学和功能分析，揭示了小胶质细胞中 ECM 重塑和细胞运动是受 h-MSCs 分泌组控制的新功能。控制 ECM 重塑的转录变化可能是促再生小胶质细胞转化的关键，这有助于在神经炎症性疾病的实验模型中发挥 h-MSCs 的保护作用，这一假设仍有待在未来的研究中探索。
参考文献：Lombardo MT, Gabrielli M, Julien-Marsollier F, Faivre V, Le Charpentier T, Bokobza C, D'Aliberti D, Pelizzi N, Halimi C, Spinelli S, Van Steenwinckel J, Verderio EAM, Gressens P, Piazza R, Verderio C. Human Umbilical Cord-Mesenchymal Stem Cells Promote Extracellular Matrix Remodeling in Microglia. Cells. 2024 Oct 9;13(19):1665. doi: 10.3390/cells13191665. PMID: 39404427; PMCID: PMC11475221.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39404427/
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