技术干货|遗传毒性杂质的不同分类及研究策略（上）|亚硝胺|化合物|基质|毒性杂质|沙坦|磺酸酯

ICH M7为遗传毒性杂质的鉴别、分类、定性和控制提供了实用框架，根据ICH M7，以诱变性和致癌性及其控制策略将杂质分为五类遗传毒性杂质：

根据我们对遗传毒性杂质的研究和来源分析，一般将常见的遗传毒性杂质分为：

• 叠氮类杂质（如AZBC、MB-X等）

• 氨基糖苷抗生素类（遗传易感性耳聋）

• 苯并芘类（苯并[a]芘；苯并[e]芘）

• 磺酸酯类（如：苯磺酸甲（乙、异丙）酯、甲磺酸甲（乙、异丙）酯等）

• 肼（水合肼、苯肼等）

• 卡铂/顺铂

• 芳香硝基化合物

• 卤代烷烃及酰卤类化合物

• 环氧化物（环氧乙烷）

• 以及其他（黄曲霉素等）

亚硝胺一般会拎出来单独评估。以下我们就抛砖引玉，分享不同分类下检测分析策略，欢迎讨论。

1.亚硝胺类化合物

老生常谈亚硝胺，亚硝胺类基因毒性杂质是公认的强致癌物。自从华海的缬沙坦事件后，国内外药物监管机构对亚硝胺的控制策略逐渐成熟。FDA、 EMA以及国内NMPA均逐步出具了亚硝胺控制、评估等指导原则，以及相关检测方法，譬如FDA公布的用于检测缬沙坦中NDMA的HS-GCMS法，其LOQ在0.3 ppm。

常见的几种亚硝胺（NDMA、NDEA、NMBA、NMPA、NDIPA、NEIPA、NDBA等）不管是FDA和EMA均有可查的AI值，而一些非常见亚硝胺类杂质，如N-亚硝基API类化合物（NDSRI），则需要通过一定数据的评估进行AI值的估算（可跳转阅读“NDSRI控制策略和分析方法研究”）。

解决办法

对于低AI值亚硝胺，常用LCMS-APCI电离源进行分析方法的开发，不同基质中仪器的灵敏度差异不大，难点在于前处理富集策略的优化。微源检测实验室开发的乳膏基质中七个亚硝胺分析方法，通过LLS分离和固相萃取MCX柱，使得方法LOQ在0.02 ppm以下；大容量XXX注射液中NDMA和NDEA的亚硝胺，其中因主药的日剂量很大，限度达到ppb级别，则对前处理富集过程要求很高，通过低温萃取，低温氮吹等技术，最终将分析方法的灵敏度做到了0.1 ppb以下。

2.叠氮类化合物

2022年4月EDQM（欧洲药品质量管理局）确认，研究表明在四唑环结构的沙坦类原料药（API）含有致突变的叠氮杂质，可引起细胞DNA变化，这些突变可能会增加患癌的风险。以缬沙坦为例，其风险评估基毒杂质4‘-(叠氮甲基)-[1,1’-联苯]-2-腈（MB-X）和5-[4‘-（叠氮甲基）[1,1-联苯]-2-基]-1H-四氮唑（AZBC）。

3.磺酸酯类化合物

磺酸酯根据取代基的不同，一般分为烷基磺酸酯和芳基磺酸酯。

烷基磺酸酯在开发时，因其高反应活性，譬如使用GCMS对其测定，进样口高温会导致其分解，同时基质中若含有磺酸，与醇类试剂瞬间反应生成磺酸酯造成假阳性现象，直接影响测定的准确性，同时不同的磺酸酯灵敏度差别较大，无法在同一个方法中同时测定，特异性欠佳。而芳基磺酸酯使用LCMS进行测定时，由于流动相不可避免会含有一定的水，其易水解的特性，导致不同的芳基磺酸酯之间存在干扰。

解决办法

A.衍生化测定。尤其是对于烷基磺酸酯（如甲磺酸甲酯、乙酯、异丙酯，乙磺酸甲酯、乙酯、异丙酯等），参考EP的方法，使用碘化钠、钾等进行取代反应，通过检测其衍生产物：碘甲烷、碘乙烷、碘异丙烷等，但由于抗氧剂硫代硫酸钠延长顶空平衡时间和升高平衡温度时会导致衍生产物（如碘甲烷）不稳定，往往需要更换抗氧剂，譬如抗坏血酸，在某些基质方法中衍生产物会更稳定。或通过更换衍生剂，譬如硫氰酸钠、五氟苯硫酚、三乙胺等，参与亲核取代，获得更稳定或灵敏度更高的衍生产物。

B.柱后水解测定。由于磺酸酯水解特性，对于芳基磺酸酯，可通过测定其源内裂解产物芳基磺酸以定量分析。通过调节流动相pH或盐浓度，使得芳基磺酸酯在柱内以分子态存在，不同芳基磺酸酯由于极性或特殊官能团不同，其在柱内得到有效分离，同时通过APCI强电离源，在柱后芳基磺酸酯均完全水解，水解产物均为芳基磺酸，但因有效分离，故互相之间不存在干扰。

以测定苯磺酸氨氯地平中苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯和苯磺酸异丙酯为例，通过合适的色谱柱和流动相，MS端检测苯磺酸MRM通道（157.00＞80.05），色谱图中三个苯磺酸酯有效分离，甲酯、乙酯、异丙酯依次出峰，如下图所示。