上一篇文章，我们根据对遗传毒性杂质的研究经验，将基因毒性杂质进行了一个大致的分类，并从分析检测的角度介绍了亚硝胺类、叠氮类化合物、磺酸酯类化合物基因毒性杂质的的实验室解决方法。这期我们将继续对芳香胺/芳香硝基化合物、卤代烷烃及酰卤类化合物、环氧化合物等基因毒杂质在的分析策略进行细说。
4.肼类化合物
理论上来说，对于挥发性较强的烷基肼可以采用GC/GCMS法进行测定，同时肼是一类质子碱，会在酸性溶液中会电离，因此也可用离子色谱法测定这类易电离的化合物。譬如使用离子交换色谱-电化学检测器测定西那普利中的水合肼，但往往此类方法灵敏度欠缺。
解决办法
A.对于烷基肼，如水合肼，一般可以通过衍生化反应，提高其沸点和响应。如水合肼、硫酸肼等，以醛、酮类衍生剂（如苯甲醛、萘甲醛、邻苯二甲醛等），生成对应的腙等产物，并通过LCMS进行分离检测，此类衍生往往需要加热以提高衍生效率。
B.而对于芳基肼，则可以直接通过LCMS方法进行检测，如塞来昔布中需要关注的两个肼盐：4-氨基磺酰基苯肼盐酸盐和4-（4-甲基苯乙酮）磺胺基苯肼盐酸盐，均可以通过LCMS-ESI-MRM检测，且灵敏度较高。
5.芳香胺和芳香硝基化合物
芳香胺类化合物分子结构中与苯环相连的氮原子经代谢活化，易生成稳定的氮正离子，能与DNA 结构中的亲核活性基团发生反应，因此具有潜在致突变性。芳香胺因含有N，往往可以直接采用LCMS进行痕量分析方法的开发。部分芳香胺的胺为三级胺，在ESI电离源中可能电离效率较低，直接测定无法满足方法的灵敏度需求，则需要通过柱前衍生以提高响应。
可选的衍生剂有醛酮类（如邻苯二甲醛）、酰基/碳基卤（如二硝基苯甲酰氯、9-氟甲氧羰基氯）、酯（如氯甲酸己酯）等。
解决办法
由于芳香硝基化合物缺乏足够的电离效率，则：
1.GCMS的EI源强电离，如常见的硝基甲苯（邻、间、对）、二硝基苯（邻、间、对）。我司对于药物中二硝基苯的分析方法，因其存在位置异构体，LCMS难分离且电离效率很低，选择了GCMS方法测定。选择DB-5等高上限使用温度色谱柱（HP-5为325 ℃），高进样口温度以增加汽化比例，能有效分离其异构体并有较高的灵敏度。
二硝基苯LOQ溶液（9 ng/mL）图谱（出峰顺序依次为对二硝基苯、间二硝基苯、邻二硝基苯）
2.衍生化，通过将硝基还原为氨基、羟胺等易电离化合物，譬如通过水合肼和Raney Ni将硝基还原为一级胺。
根据所含卤原子的种类，可以分为氟代烷、氯代烷、溴代烷和碘代烷。因卤代烷烃的反应活性较强，能直接与生物大分子（如DNAs，RNAs，蛋白子等）发生烷基化反应，从而导致DNA突变。
解决办法
A．挥发性卤代烷烃。常见易挥发性的有卤代甲烷、卤代乙烷、卤代丙烷等（如：氯甲烷、氯乙烷、氯丙烷、碘甲烷等等），因此常用GC或GC-MS进行分析检测。如我司采用的GC-ECD对某药物中的溴甲烷、碘甲烷、溴乙烷和碘乙烷进行检测，各卤代烃LOD能到10 ng/mL。相对的氯代烷烃，则更适合使用HS-GC-MS进行分析，其灵敏度较HS-GC-ECD检测器能高5-20倍。
B． 半挥发或不挥发卤代烷烃。常见的有氯乙醇、1-氯丁醇、酱油中极易产生的三氯丙醇（3-氯-1,2-丙二醇，3-MCPD）等等，由于沸点较高，不适合气相色谱法检测，结构中只有氯原子取代也使得ECD 的灵敏度和回收率较低。
微源实验室在开发相关杂质分析方法时采用了两种思路：
① 衍生化：采用七氟叔丁基氯对氯乙醇和1-氯丁醇进行衍生，其衍生产物引入多个氟，沸点降低，挥发性增加，可直接使用GC-ECD方法即可提高灵敏度，LOD能达到5 ng/mL；或使用二甲胺等胺类实际进行衍生化反应，因引入氨基，GC-MS方法中灵敏度做到1 ng/mL以下。
②富集GCMS分析，通过SPE或LLE等萃取浓缩方式，并使用灵敏度和特异性相对较高的GCMS检测方法进行定量分析。
C． 酰卤类化合物。对于脂肪族酰卤类化合物，往往采用衍生化的方法进行检测。芳香族酰卤虽然有共轭结构，HPLC方法有较大吸收，但由于易水解的原因，如苯甲酰氯，遇水易水解成苯甲酸，HPLC方法中特异性不高。实验室在实操过程中对某芳香酰氯化合物采用柱前衍生-LCMS方法，通过在有机溶剂中（使用前除水）与苯肼、硝基苯胺类衍生剂反应，通过测定其衍生产物以定量药物中芳香酰氯化合物。
7.环氧化合物
具有一定挥发性的环氧化物，可以用GC/GCMS直接测定，如环氧氯乙醇，通过直接进样GC-FID定量。但此类方法精密度一般不易控制，是由于待测物在进样口易分解，因此需要采用柱上进样技术或低温顶空进样。
解决办法
对于非挥发或半挥发性的环氧化物，则可以通过LCMS进行检测。如倍他米松和地塞米松的差向异构体对16α-甲基环氧化物和 16β-甲基环氧化物，通过LC分离，MS检测，方法灵敏度和特异性均满足需求。对于部分环氧化物，一方面由于其化学性质不稳定，同时由于其是中性分子，在ESI电离源中难以质子化，灵敏度无法满足分析需求，则需要另辟蹊径，通过衍生化后，以LCMS进行检测分析。如3,5-二氟苄胺、N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺和亚硫酸钠等作为衍生剂。
药物中基因毒性杂质的检测虽然仍然属于药物中有机杂质检测的范畴，但在灵敏度、选择性、待测物稳定性、基质复杂性等方面具有特殊性，因此需要我们选择合适的分析方法，开发合适的前处理步骤。针对基因毒性杂质分析方法的建立实验室提供以下思路供各位药企伙伴参考：
√ 微源检测实验室积累丰富基因毒性杂质研究经验，完结亚硝胺等百余项基因毒性杂质检测项目，积累了警示结构的分析方法，包括亚硝胺类、磺酸酯类、叠氮类、肼类、卤代烷烃及酰卤类化合物、芳香胺和芳香硝基化合物、不饱和酮，醛类等已知的所有警示结构。
√ 可为基因毒性杂质研究提供工艺评估、控制策略制定、分析方法开发、验证及放行检测等一站式解决方案。针对工艺进行全面评估，结合毒理学数据分析和法规解读，制定合理的控制策略，出具完整的评估及控制分析报告。
√ 至今已完成近50个品种的100多套基因毒性在杂质研究，采用LC-MS、GC-MS等高灵敏度仪器开发分析方法并验证，满足基因毒性杂质高难度限度极低等分析要求，服务多家企业，符合各种法规要求，帮助不同品种的研究资料申报成功。如您有相关需求欢迎咨询！
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