很多新手同学在进行RNA逆转录和荧光定量实验时常常会遇到做不出来，或检测CT值太大的情况，这通常被认为是目标基因未能被扩增或模板中目标基因表达水平非常低的情况，而这更常见于两步法荧光定量的实验结果中。其可能的原因有RNA未被有效逆转录、荧光定量模板受污染、两步法检测灵敏度不够等等。

要解决此类问题，首先要保证RNA能被有效逆转录，有的RNA模板中含有复杂的二级结构或高GC片段，需提高温度才能使RNA变性，而普通二代逆转录酶往往耐高温能力不够，因此有些基因片段无法被有效逆转录。新手研究者可以首选使用第三代逆转录酶，相比较第二代，有更好的耐高温性能，可将逆转录温度提高至55℃，避免RNA复杂二级结构对cDNA合成的抑制，以保证荧光定量结果的准确性。

其次，舍弃两步法改用一步法进行实验，即将RNA逆转录和荧光定量在同一反应管内一步完成。如此一来，不仅可以降低两步法中开管动作带来的污染风险，而且可以将逆转录的所有产物都用于荧光定量的检测，从灵敏度上来说，可比两步法提高十倍的灵敏度，对于检测样本中丰度较低的基因来说，这种方法尤其合适。同时，操作层面上，更加简便，新手研究者更易上手，可有效降低实验失败的概率！

综合上述两点，我们可以选择配有第三代逆转录酶的一步法荧光定量试剂盒来进行实验，如BIOG的BIOGHCElitefast SYBR One Step Kit，如下是实验测试数据，小伙伴们可以了解一下哦~

打开网易新闻 查看精彩图片