脊椎动物发育过程中，胚胎轴线形成对于后续体轴发育及命运图谱建立至关重要。这一过程由组织中心 （Organizer） 严格控制，而母源β-catenin信号在其中扮演着核心角色。1924年，德国胚胎学家Hans Spemann和Hilde Mangold通过对蝾螈胚胎的移植实验，首次揭示了背侧组织中心的存在【1】。后续研究陆续在鸟类、小鼠和斑马鱼中发现组织中心决定胚胎体轴发育【2-4】。2018年，清华大学孟安明院士和陶庆华教授课题组联合发现了体轴决定因子Huluwa/Hwa（） （葫芦娃） ，其通过β-catenin信号通路调控胚胎体轴建立【5】。陈静教授当时作为共同一作，鉴定了hwa基因并阐明了主要信号转导通路。尽管关于Hwa蛋白的负向调控方式逐步被揭示，如溶酶体相关降解路径参与Hwa功能调控【6, 7】，然而Hwa/β-catenin信号通路的激活及下游信号转导机制尚不明确。
2024年11月19日，四川大学华西医院陈静教授团队在Nature Communications上发表了题为A Huluwa phosphorylation switch regulates embryonic axis induction的研究论文【8】。该研究揭示了Hwa蛋白第168位丝氨酸（Ser168）磷酸化修饰在斑马鱼胚胎体轴建立中的关键作用，阐明了Hwa/β-catenin信号通路细胞膜上的磷酸化分子开关。这一发现不仅深化了对Hwa蛋白本身的理解，更为早期胚胎发育信号调控互作提供了阐述，成为陈静团队在形态发生研究中的又一重要贡献。
Hwa是一个单次跨膜蛋白，N端胞外区较短，C端胞内区富含结构相对松散无序区段，具有一个相对保守PPNSP基序 （类似于Lrp5/6共受体的PPP(S/T)P基序） 。为探究Hwa蛋白的关键功能位点，研究团队首先利用hwa母源突变体 (Mhwatsu01sm/tsu01sm) 的体轴挽救实验对候选位点进行筛选，发现Hwa蛋白Ser168位点对体轴诱导不可或缺，该位点的单氨基酸替代 （S168A） 将显著削弱Hwa蛋白的体轴诱导能力。而该位点定位于相对保守的PPNSP基序中，不同物种中Hwa同源蛋白对应位点突变都影响体轴诱导活性。在机制上，缺失或突变Ser168位点降低了Hwa与Tankyrase 1/2的结合亲和力，使Axin蛋白的降解受阻，从而阻碍了下游β-catenin信号通路的激活。
图1 Ser168对Hwa蛋白的体轴诱导活性不可或缺
（a）斑马鱼 Hwa 蛋白的结构域和基序组成。（b） 由不同 mRNA 挽救的 hwa突变体胚胎的表型。（c） 根据 （b） 中的分类标准Hwa(163-170Aa) 不同位点突变 mRNAs 的体轴挽救效率统计结果。（d）Hwa蛋白及PPNSP基序在脊索动物中的保守性分析。(e) 文昌鱼（amphioxus）、海鞘（sea squirt）及蛙（frog）的野生型（WT）和 突变型mRNA的体轴挽救效果统计结果。
此外，研究团队通过LC-MS/MS鉴定了Ser168位点的磷酸化修饰，并发现多种激酶，如Cdk16、Cdk2和GSK3β等在体内 （in vivo） 和体外 （in vitro） 都能增强Ser168的磷酸化。激酶共表达将增强Hwa的轴诱导活性，而显性负效应Cdk16DN和pHwa (Ser168) 抗体处理则会抑制Hwa蛋白的体轴诱导活性，这进一步论证了该位点磷酸化修饰在体轴诱导中的关键作用。
最后，研究团队利用CRISPR/Cas9结合ssDNA donor定点编辑技术，建立了单碱基编辑的hwaS168A突变体模型，MhwaS168A/S168A突变体胚胎呈现体轴完全缺失的表型；与此同时，通过与hwa基因表达缺失突变体hwatsu01sm进行杂交获得的复合杂合胚胎 （MhwaS168A/tsu01sm） ，也呈现体轴完全缺失表型。总之，通过严格的内源性遗传证据表明Ser168对斑马鱼胚胎体轴的形成至关重要。
图2 S168A定点编辑突变体表现为体轴发育缺失
(a) CRISPR/Cas9构建斑马鱼S168A突变体策略设计；(b) S168A纯合突变体基因型鉴定结果；(c) S168A纯合胚胎表现为体轴缺失的表型（可分为两个亚型）；(d) S168A纯合突变体中, 4 hpf和6 hpf组织中心及背侧命运基因（boz、chd和gsc）表达下调，腹侧命运基因（vox、bmp2b和vent）表达上调。
以上实验证据表明Hwa蛋白Ser168位点对斑马鱼胚胎体轴发育不可或缺，其可被Cdk16、Cdk2和GSK3β等多种激酶磷酸化，充当Hwa/β-catenin信号通路激活的磷酸化分子开关。该研究提出了一个磷酸化精准调控模型，为解码脊椎动物胚胎体轴形成的分子机制提供了新视角，同时也为β-catenin信号通路的复杂调控网络增添了重要一环。
值得一提的是，今年正值Organizer发现100周年，该研究发现了Organizer关键调控蛋白Hwa的磷酸化分子开关，为我们对Organizer的理解提供了进一步的认识，这一工作的发表也是对Organizer世纪纪念的献礼致敬。展望未来，该研究团队认为Hwa蛋白磷酸化分子开关可能是一种普遍机制，为探究体轴诱导中的关键因子，以及细胞命运决定、其他激酶和发育冗余信号通路之间的相互作用提供了新的契机。
图3 Hwa的Ser168磷酸化分子开关调控Hwa/β-catenin信号通路激活
四川大学华西医院/华西临床医学院陈静教授为通讯作者，其研究生李瑶、严芸，以及康奈尔大学威尔医学院的青年学者龚波为共同第一作者。四川大学华西医院小儿外科研究室郑倩文、周海燕、孙佳睿、李明澎、王照、李垚辉、万芸婧、陈韦西等参与了该研究工作。
陈静课题组致力于形态发生的信号和机制研究，长期招收发育生物学、遗传学、分子/细胞生物学及生物信息学方向的博士后和研究生（非临床-学术型），欢迎感兴趣的同学投递简历。
课题组介绍详见：https://yjs.cd120.com/contents/525/2351.html
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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-54450-4
制版人：十一
参考文献
1. Spemann H, Mangold H. The induction of embryonic predispositions by implantation of organizers foreign to the species.Arch Mikrosk Anat En1924; 100:599-638.
2. Waddington CH. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.J Exp Biol1933; 10:38-U34.
3. Beddington RS. Induction of a second neural axis by the mouse node.Development1994; 120:613-620.
4. Shih J, Fraser SE. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage.Development1996; 122:1313-1322.
5. Yan L, Chen J, Zhu X, Sun J, Wu X, Shen W, Zhang W, Tao Q, Meng A. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates.Science2018; 362(6417):eaat1045.
6. Zhu X, Wang P, Wei J, Li Y, Zhai J, Zheng T, Tao Q. Lysosomal degradation of the maternal dorsal determinant Hwa safeguards dorsal body axis formation.EMBO Rep.2021; 22(12):e53185.
7. Tejeda-Muñoz N, De Robertis EM. Lysosomes are required for early dorsal signaling in the Xenopus embryo.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2022; 119(17):e2201008119.
8. Li, Y., Yan, Y., Gong, B. et al. A Huluwa phosphorylation switch regulates embryonic axis induction.Nat Commun15, 10028 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54450-4
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