疫苗前沿 | 用于单剂量干粉气雾剂免疫的吸入SARS-CoV-2疫苗|2019冠状病毒病疫苗|sars|免疫|干粉|抗体|抗原|气雾剂|流感疫苗

大家好，今天分享一篇来自中国科学院过程工程研究所马光辉院士和魏炜研究员团队联合军事医学科学院生物工程研究所朱力研究员、王恒樑研究员团队共同通讯于2023年12月发表在Nature上的题为“Inhaled SARS-CoV-2 vaccine for single-dose dry powder3 aerosol immunization”的文章。作者开发了一种可吸入的单剂量干粉气溶胶SARS-CoV-2疫苗，可诱导有效的全身和粘膜免疫反应。该疫苗将组装的纳米颗粒包裹在最佳空气动力学尺寸的微胶囊中，该微胶囊包含展示SARS-CoV-2 RBD抗原的蛋白质霍乱毒素B亚基，这种独特的纳-微耦合结构支持有效的肺泡递送、持续的抗原释放和抗原提呈细胞吸收，这些都是诱导免疫反应的有利特征。

背景知识

随着全球范围内COVID-19疫情的蔓延，疫苗成为防控疾病传播的关键工具。迄今为止，多种类型的 SARS-CoV-2 疫苗，例如灭活疫苗、蛋白亚单位疫苗、 mRNA 疫苗和病毒载体疫苗已获得批准。其中大多数是通过肌肉注射给药的，可诱导血清学 IgG 的产生，从而中和病毒的传染性并缓解 COVID-19。然而，由于分泌型 IgA 和 IgG 缺乏，肌肉注射疫苗并不能在呼吸道提供第一道保护。

为了克服肌肉注射的问题，几种用于鼻内或雾化给药的候选疫苗正在开发中或已获得批准，其中大多数基于病毒载体，例如腺病毒、减毒流感病毒、副流感病毒或新城疫病毒。值得注意的是，人类临床研究表明，吸入疫苗可以诱导与肌肉注射疫苗类似的抗体反应，但剂量远低于注射疫苗。然而，到目前为止，为鼻内或雾化给药开发的疫苗是液体形式，需要冷链运输和储存，通常需要两到三次吸入免疫或使用异源加强疫苗接种。

鉴于这种背景和已知存在于肺部的丰富免疫细胞，作者尝试开发一种适合单剂量吸入的干粉疫苗，这个目标需要考虑几个因素。具体来说，疫苗载体在冻干后应保持其结构和性能。由于较小的颗粒容易随气流呼出，而较大的颗粒往往会沉积在浅肺中，因此空气动力学尺寸必须控制在 1-4 μm 范围内，以便在深肺中主要沉积（在肺泡中）。此外，具有缓释特性的疫苗颗粒可以提供持续的抗原刺激，这可能会诱导持久的免疫反应。

Design and preparation of R-CNP and R-CNP@M

Fig 1.

作者通过使用 SpyTag–SpyCatcher 生物正交系统构建一种自佐剂纳米载体（CNP），并展示了它在呈递抗原方面的有效性。具体来说，作者将抗原的受体结合域（RBD）展示在 CNP 上，以提高抗原的稳定性、抗原呈递细胞（APC）的摄取和激活。

作者通过将一个形成三聚体的肽连接到CTB（霍乱毒素B）亚单位的C端，研究者构建了一个自佐剂的纳米载体。CTB本身具有粘附于粘膜的能力，而该载体的设计利用了SpyTag–SpyCatcher系统，将抗原（如RBD）以共价键形式固定在CNP上，从而增强其免疫反应性（图 1a）。SDS-PAGE和免疫印迹分析（Western blot）表明，SC-RBD蛋白与ST-CNP 发生了共价结合。在图1b中，可以观察到SC–RBD组分的分子量出现了明显的变化，证明了SpyTag和SpyCatcher系统成功地连接了CNP和RBD。透射电子显微镜（TEM）图像显示，R-CNP（RBD-CNP复合物）具有分散良好的纳米颗粒特征。这表明CNP作为纳米载体的结构稳定，并且尺寸均一，适合作为抗原递送平台（图 1c）。通过表面等离子共振（SPR）实验，研究者检测了RBD单体和R-CNP与人ACE2受体的动力学。实验结果表明，RBD单体和R-CNP在与ACE2受体的结合过程中表现出相似的剂量依赖性，说明R-CNP上的表位得到了正确的暴露和折叠，从而能够有效与ACE2受体结合（图 1d）。

随后，作者使用了膜乳化法制备多孔PLGA微球，这些微球能够将R-CNPs（带有标记的纳米颗粒）有效地包裹其中。通过简单的混合和温和的加热封装过程，这些微球得以形成。膜孔径、渗透梯度等参数被精细调整，从而可以控制微球的粒径、孔隙度和腔体体积。此方法优化了R-CNP@M微胶囊的气动大小和高封装效率（图 1e）。经过冻干处理后，R-CNP@M变成了白色粉末，具有良好的分散性，并且可以用干粉雾化发生器（DPAG）喷雾形成均匀的雾霾。此粉末几乎完全位于期望的气动直径范围（2-4 μm），该粒径范围适合进行有效的肺泡递送（图 1f，g）。测试结果显示，释放后的R-CNP与新鲜R-CNP在结合人类ACE2（hACE2）受体的亲和力上没有显著差异。这表明，R-CNP在微胶囊内的持续释放不影响其生物活性（图 1h）。

综上所述，该研究通过微胶囊设计显著提高了纳米颗粒的肺泡沉积效果，并提供了持续的抗原刺激支持，且具备良好的存储稳定性。这种设计方法为提高肺部递送药物或疫苗的效率提供了新的思路。

In vivo biodistribution and release

随后，作者对吸入型微胶囊疫苗（R-CNP@M）在小鼠体内的药物动力学、释放和摄取特性进行了详细研究，验证了其在肺部的递送、持续抗原刺激和与抗原呈递细胞（APCs）的相互作用。

为研究疫苗的肺部保持、沉积、释放和摄取特性，作者使用了干粉吸入器（DPI）将含有Cy7标记的R-CNP的微胶囊疫苗递送到小鼠体内，同时设有对照组，采用气雾化方式给小鼠递送等量Cy7标记的R-CNP（图 1i）。接下来通过比较两组小鼠在肺部的信号强度变化，来研究微胶囊的效果。在R-CNP组小鼠的肺部，5天后几乎没有检测到荧光信号；而在R-CNP@M组小鼠的肺部，5天后仍有50%的初始信号强度，且直至42天仍能检测到荧光信号。与R-CNP组相比，R-CNP@M的信号保持时间显著延长。这表明微胶囊能够在肺部持续提供抗原刺激（图 1j）。用链霉亲和素- AF647和尼罗红分别标记气管和微胶囊，并用薄层显微镜检查其分布。以吸入后第5天右上肺叶为例，微胶囊均匀分布于肺叶（图 1k）。全肺组织切片（第5天）显示，气管、原发性支气管和继发性支气管中微胶囊较少，微胶囊大部分沉积在肺远端，包括末端支气管和肺泡（图 1l）。第10天的组织切片显示R-CNP与微胶囊没有共定位，表明R-CNP已从微胶囊中成功释放，并且能够在肺部持续发挥作用（图1m）。流式细胞术结果显示，约50%的APCs呈现R-CNP阳性信号，表明R-CNP能够有效被APCs摄取（图1n）。

综上所述，这项研究验证了R-CNP@M疫苗能够高效地递送到肺泡，并且通过微胶囊释放的R-CNP能够被APCs摄取，从而支持持续的抗原刺激。R-CNP@M疫苗具有显著的肺部递送优势和免疫激活潜力，是一种非常有前景的呼吸道疫苗递送平台。

Potent responses of immune cells

Fig 2.

接下来，作者使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析吸入型疫苗对小鼠肺部免疫反应的影响，并进一步评估了T细胞和B细胞的免疫反应。研究重点是通过比较不同疫苗组（包括R-CNP和R-CNP@M组）在免疫反应中的差异，尤其是针对SARS-CoV-2的免疫保护效果。

作者使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术分析了肺部免疫细胞（CD45+）的转录组情况，评估了免疫反应。scRNA-seq数据表明，免疫细胞分为九种不同类型（图 2a），其中重点分析了抗原呈递细胞（APCs），如树突状细胞和巨噬细胞。树突状细胞和巨噬细胞的激活标志基因（如Cd40、Cd86）在接种组中显著上调，其中R-CNP@M组表现出最高的上调（图 2b）。这表明R-CNP@M疫苗比其他疫苗更有效地激活了APCs。激活APCs中的几个与归巢相关的基因（如H2-Ab1、Cd74）上调，提示这些APCs可能迁移到纵隔淋巴结（mLNs）（图 2c）。在下呼吸道，R-CNP@M组的CD8+记忆T细胞比例在免疫后21天和70天均显著高于其他组，且持续存在（图 2d）。R-CNP组的CD8+组织驻留记忆T细胞（TRM）在70天时明显减少，而R-CNP@M组的比例则保持在约21%（图 2e）。通过鉴定RBD表位，作者发现R-CNP@M组在下呼吸道中诱导最强的IFNγ分泌的TRM细胞反应，且这种反应持续时间较长（图 2f）。通过流式细胞术评估细胞因子（IFNγ、TNF和IL-2），R-CNP@M组显示出更多的双阳性和三阳性CD8+T细胞（图 2g），表明其能够诱导更多的多功能T细胞，这对于抗击SARS-CoV-2变异株有重要意义。通过光片显微成像，R-CNP和R-CNP@M组显示B细胞滤泡的显著增大，特别是后者显示更多的生发中心（GCs）B细胞（图 2h）。这表明R-CNP@M能够有效诱导B细胞反应，特别是在B细胞的生发中心反应中。通过流式细胞术，R-CNP@M组显示最高比例的生发中心B细胞（IgD−GL7+B220+），进一步支持其强烈的体液免疫反应（图 2i）。

综上所述，R-CNP@M疫苗不仅显著提高树突状细胞和巨噬细胞的激活，还能够维持强大且持久的CD8+和CD4+T细胞反应，尤其是针对抗体逃逸变异株的免疫保护作用。此外，B细胞的活化和记忆B细胞的形成也进一步增强了体液免疫反应。这些结果表明，R-CNP@M具有较强的免疫效果，可能成为对抗新冠及其他病毒的有效疫苗策略。

Antibody response and protective effect

Fig 3.

作者评估了R-CNP@M疫苗在小鼠和仓鼠中的免疫反应以及其对SARS-CoV-2的保护效果。研究重点是通过单次免疫R-CNP@M对抗体产生、粘膜免疫反应、疫苗中和抗体效价、以及细胞免疫反应的影响。作者还比较了免疫后的长期抗体反应以及疫苗对野生型SARS-CoV-2的保护作用。

通过ELISA测定小鼠血清中针对RBD的抗体滴度（IgM、IgG、IgG1和IgG2a）。结果显示，R-CNP@M组在单次免疫后迅速且强烈地提高了抗RBD抗体的水平，而游离R-CNP组需要两次免疫才能达到类似水平（图 3a）。R-CNP@M组的抗RBD抗体水平在12个月内持续维持较高水平，这表明微胶囊中的抗原持续释放可能导致长期的免疫反应（图 3b）。使用支气管肺泡灌洗液（BALF）评估了小鼠的粘膜免疫反应。R-CNP@M接种组的BALF中显示较高水平的针对RBD的IgA和IgG抗体，而游离R-CNP组的IgA和IgG抗体水平较低，CNP组则未检测到这些抗体（图 3c）。使用伪病毒中和实验评估了血清和BALF中的中和抗体效价（pVNT50）。结果显示，R-CNP@M组在所有变异株中均表现出最强的中和抗体反应，特别是针对D614G变异株，R-CNP@M组的pVNT50显著高于R-CNP组（图 3d、e）。R-CNP@M组的持续抗原刺激有助于中和抗体效价的提高，证明其优越的免疫反应。作者将仓鼠通过干粉吸入器（DPI）接种R-CNP@M疫苗（30 μg RBD），PBS组作为对照（图 3f）。结果显示，与PBS组相比，R-CNP@M组显示了显著更高的抗RBD IgG抗体滴度（图 3g），以及更高的SARS-CoV-2中和抗体效价（图3h），表明R-CNP@M能够在全身和粘膜中诱导免疫反应。R-CNP@M组的肺部和鼻腔中的SARS-CoV-2病毒RNA和感染性病毒数量显著低于PBS组（图 3i、j），进一步证明其免疫保护效果。通过免疫组织化学和苏木精-伊红染色，观察到PBS组肺部中有大量的SARS-CoV-2核衣壳蛋白、明显的肺泡间隔增厚和显著的炎症细胞浸润，而R-CNP@M组则没有这些病理特征（图 3k）。

综上所述，R-CNP@M疫苗在小鼠和仓鼠模型中均表现出优异的免疫反应和保护效果，尤其是在诱导持久的抗体和强大的细胞免疫反应方面。该疫苗通过持续释放抗原，能够提供长期有效的免疫保护，尤其在抗击SARS-CoV-2变异株方面具有显著优势。与常规的肌肉注射疫苗不同，R-CNP@M能够同时激发全身免疫和粘膜免疫反应，从而增强免疫保护效果。

Immune responses in nonhuman primates

Fig 4.

为使R-CNP@M疫苗更接近临床应用，作者进一步在非人类灵长类动物（如猴子）中评估了疫苗的免疫效果和安全性（图 4a）。通过干粉吸入器（DPI）免疫非人类灵长类动物后，作者探讨了疫苗在呼吸道中的沉积情况、免疫反应以及其对SARS-CoV-2的保护效果。用尼罗河红色标记疫苗治疗的一只猴子在免疫14天后被安乐死，取出肺组织进行冷冻切片和成像。结果显示，R-CNP@M颗粒大多数沉积在肺泡中，只有少量微胶囊出现在气管和支气管（图4b和4c），这表明R-CNP@M能够有效地到达肺泡，并实现目标区域的良好沉积。。血清中抗RBD的IgG抗体滴度在R-CNP@M组中持续保持在10⁴以上，并且与免疫14天后的抗体质量相比，84天时的抗体质量更高，表明该疫苗能维持持久的免疫反应（图 4d、e）。在BALF中，R-CNP@M组显示出较高的抗RBD IgA和IgG抗体滴度，说明疫苗能够引发强大的粘膜免疫反应，保护呼吸道免受病毒入侵（图 4f）。R-CNP@M组的血清和BALF均表现出对伪病毒和活病毒的良好中和效力，表明该疫苗能够有效地对抗SARS-CoV-2变异株和野生型病毒的感染（图 4g、h）。

综上所述，R-CNP@M疫苗在非人类灵长类动物中的实验结果显示了其良好的免疫原性、持久的免疫反应以及高效的抗体产生。尤其是该疫苗能够通过DPI方式激活强大的系统性免疫和粘膜免疫反应，并在血清和BALF中均表现出显著的中和抗体效力。此外，R-CNP@M在安全性方面也表现出良好特性，为未来的临床研究和应用奠定了基础。

Mosaic iteration for broader immunity

Fig 5.

为应对多个SARS-CoV-2变异株共存的挑战，作者设计了一种新的抗原展示平台：RWTRO-CNP@M，它同时展示野生型RBD（RWT）和Omicron RBD（RO）。这些RWTRO-CNP@M微胶囊（与单一展示的RWT-CNP@M和RO-CNP@M进行比较）通过干粉气溶胶方式免疫小鼠，评估其免疫原性、抗体产生和病毒中和效果。

在免疫28天后，RWTRO-CNP@M组小鼠显示出较高的抗RBDWT和抗RBDO抗体滴度，而RWT-CNP@M和RO-CNP@M组对于未匹配的RBD抗体滴度明显降低（图 5b）。这表明RWTRO-CNP@M疫苗可以有效产生同时针对两种RBD的抗体反应。RWTRO-CNP@M组的血清能够有效中和野生型和Omicron变异株的伪病毒，而单独使用RWT-CNP@M和RO-CNP@M疫苗的血清无法中和未匹配株的伪病毒（图 5c）。即便血清中的IgG抗体滴度高于10⁴，单一疫苗的中和效果仍有限。对于支气管肺泡灌洗液（BALF），也观察到类似的结果，RWTRO-CNP@M组能有效中和两种株的伪病毒，而RWT-CNP@M和RO-CNP@M组则无法中和未匹配株的伪病毒（图 5d、e）。通过对十个免疫学指标（如抗体反应、样本来源、检测方法等）进行降维处理，研究发现三种疫苗组的数据在主成分分析中被明显区分开来，表明不同疫苗组在免疫反应特征上有显著差异（图 5f）。热图可视化显示，RWT-CNP@M和RO-CNP@M疫苗对于未匹配株的免疫学指标非常低，而RWTRO-CNP@M疫苗在野生型和Omicron变异株的免疫反应中，几乎所有免疫学指标的z分数都显著较高（图 5g）。这证明了RWTRO-CNP@M疫苗在增强免疫广度方面的优势。

综上所述，RWTRO-CNP@M疫苗的设计通过展示两种不同的RBD抗原（野生型和Omicron）显著扩大抗体反应的广度，使其能够同时针对两种SARS-CoV-2变异株提供有效的免疫保护。该疫苗能够在免疫应答中产生广谱抗体，并有效地中和多种变异株的病毒，尤其在面对多种变异株共存的情境下，具有潜在的广泛应用价值。

Benefits against host–host transmission

最后，作者为评估RWTRO-CNP@M吸入式疫苗在防止宿主间传播中的潜在益处，进行了小鼠与仓鼠的实验。这些实验旨在测试吸入式疫苗相较于传统的肌肉注射疫苗，在空气传播、接触传播和传播屏蔽模型中对于Omicron变异株的防护能力（图 5h）。

为模拟空气传播的情境，作者设计了一个带有隔离栏的笼子，确保空气流通但不允许直接接触或由物品传播病毒（图 5i）。在该模型中，一只感染Omicron的仓鼠被放置在笼子一侧，24小时后，三只接种了PBS、吸入疫苗或肌肉注射疫苗的仓鼠分别放置在另一侧，暴露于感染仓鼠的空气中。结果显示，吸入疫苗组在病毒载量（RNA拷贝数）和病毒感染活性（TCID50）上都表现出最低值（图 5j、k）。吸入疫苗组的病理评分也显著低，肺部组织几乎没有病理损伤（图 5l）。这表明吸入式疫苗在空气传播的保护效果上优于传统的肌肉注射疫苗。

为了测试空气传播的屏蔽效果，作者使用了与上述空气传播保护模型类似的笼子（图 5m）。实验中，仓鼠在接受不同疫苗（吸入疫苗、肌肉注射疫苗或PBS）的处理后，与感染Omicron的病毒接触。暴露24小时后，将仓鼠与疫苗接种的仓鼠隔离。结果显示，接受吸入疫苗的仓鼠鼻部样本中的病毒载量显著减少（图 5n）。结果还表明，暴露于吸入疫苗处理的仓鼠感染率最低，仅有3/12仓鼠感染；而暴露于PBS处理的仓鼠中有11/12仓鼠感染，暴露于肌肉注射疫苗的仓鼠中有8/12仓鼠感染（图 5o、p）。这一结果表明，吸入疫苗能够显著减少Omicron变异株的宿主间传播。

综上所述，吸入式RWTRO-CNP@M疫苗在防止SARS-CoV-2（Omicron变异株）通过空气传播和接触传播的过程中，比肌肉注射疫苗更加有效。通过诱导强大的呼吸道免疫反应，吸入疫苗不仅能够减缓宿主之间的病毒传播，还能够在高传染性病毒流行的情况下提供保护。

总结

本研究开发了一种可吸入的单剂量干粉气雾剂SARS-CoV-2疫苗，具有多项优势。与传统的肌肉注射疫苗相比，这种吸入式疫苗能够在小鼠、仓鼠和非人类灵长类动物中诱导更强的系统性和粘膜免疫反应，长期产生高水平的IgG，并在BALF中诱导丰富的IgA反应。同时，疫苗提供了有效的保护，能够阻止Omicron变异株的感染，减少病毒传播。

该疫苗采用干粉形式，具有较低的储存和运输成本，能够在远程地区广泛应用。此外，气雾颗粒能够深入肺部，比鼻用疫苗有更广泛的覆盖范围，避免了病毒载体疫苗可能存在的免疫逃逸问题。

总体而言，该疫苗不仅具有灵活性，能够展示不同抗原，还具有广阔的应用前景，能够应对COVID-19及其他呼吸道传染病，未来可作为一种多价平台疫苗广泛应用。

学习心得

这篇关于吸入式SARS-CoV-2疫苗的研究文章让我深刻认识到创新疫苗研发在应对全球大流行中的巨大潜力和重要性。以下是我从文章中得到的一些关键学习心得：

1. 吸入式疫苗的优势

方便性和高效性：传统的注射疫苗通常需要多次接种，而吸入式单剂量疫苗则提供了一个便捷的替代方案，尤其是在应急情况下，可以显著提高疫苗接种率。这对于全球疫苗普及，尤其是在偏远地区，具有重要意义。

较低的储存和运输成本：疫苗采用干粉形式，无需冷链运输，大大降低了疫苗存储和运输的复杂性，适应了不同地区和资源有限的环境。这一点对全球免疫覆盖率的提升至关重要。

2. 疫苗的免疫效果

强大的免疫反应：研究表明，吸入式疫苗不仅在体内诱导了长期且强效的IgG反应，还能够在支气管肺泡灌洗液（BALF）中诱导出丰富的IgA反应，这对于防止SARS-CoV-2在上呼吸道的初期感染至关重要。

增强的抗体反应广度：通过在微胶囊中共展示两种不同的RBD（野生型和Omicron变异株），该疫苗成功扩展了抗体反应的广度，显示出能够应对多种SARS-CoV-2变异株的潜力。这种多价疫苗设计的创新性为未来应对多个变异株的挑战提供了思路。

3. 疫苗的肺部递送机制

精准的肺部递送：该疫苗通过干粉气雾剂送入，微胶囊的适宜气动直径确保了疫苗能够有效沉积在肺泡中，释放的纳米颗粒（R-CNPs）能被抗原呈递细胞（APCs）快速摄取，启动局部的免疫反应。这种递送方式不仅提高了免疫效率，还能更好地模拟自然的病毒感染过程，增强免疫系统的应答能力。