【期刊简介】
【题目及作者信息】
【摘要】
鬼臼毒素（PPT）是从传统中药八角莲（DV）中提取出的一种高含量、高活性成分，具有多种生物活性。然而，其强烈的毒性限制了应用。在临床上，患者服用大剂量八角莲后常在短时间内出现不良反应。心脏是重要的毒性靶器官，因此有必要对PPT进行24小时急性心脏毒性研究，以了解其潜在的毒性机制。本研究基于毒理证据链（Toxicological Evidence Chain, TEC），利用靶向代谢组和转录组分析揭示PPT急性心脏毒性机制。将SD大鼠的毒性表现，如体重和行为变化等，作为损伤表型证据（Injury Phenotype Evidence，IPE）。通过对大鼠心脏进行组织病理学检查，并测量心肌酶和心脏损伤标志物水平，作为不良结局证据（Adverse Outcomes Evidence，AOE）。此外，还通过相关性分析将转录组分析、代谢组分析、心肌酶和心脏损伤标志物相结合，以进一步获得毒性事件证据（Toxic Event Evidence，TEE）。结果显示，暴露于120 mg/kg PPT后的24小时内，PPT组大鼠出现明显的口鼻出血、活动减少和弓背行为，血清心肌酶水平升高、心脏损伤生物标志物浓度升高以及心脏细胞形态改变，上述结果均表明PPT存在一定程度的心脏毒性。转录组分析显示，PPT暴露后主要的代谢途径改变为花生四烯酸代谢。Cyp2e1和Aldob与差异代谢产物呈正相关，而DHA与差异基因Fmo2和Timd2以及心脏损伤标志物BNP和Mb呈正相关。本研究全面评估了鬼臼毒素（PPT）的急性心脏毒性，并初步揭示了PPT诱导急性心脏毒性的机制，该机制涉及氧化应激、凋亡、炎症反应以及能量代谢紊乱。
【前言】
鬼臼毒素（PPT）是从传统中药（TCM）植物八角莲（Dysosma versipellis， DV）中提取的高含量、高活性成分，其在DV中的含量可高达9%。PPT具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗病毒和抗炎作用，特别是其抗肿瘤活性已证实能够抑制非小细胞肺癌、人口腔鳞状细胞癌等多种癌细胞的增殖（Pathak等人，2022；Tan等人，2018；Zhao等人，2021）。然而，PPT的毒性、严重的胃肠道不良反应以及中毒后缺乏特效药物限制了其临床应用（Kong等人，2023）。DV引起的毒性涉及多个器官，其中心脏是重要的靶器官。因此，PPT可能对心脏造成损害，但这一点尚未得到证实，且相关毒性机制尚不清楚。因此，有必要进行系统和全面的分析，以探索PPT的心脏毒性及其作用机制，从而推动其在治疗中的应用。
2019年，课题组首次提出并应用了毒理证据链（Toxicological Evidence Chain, TEC），以研究化合物和天然药物的潜在毒性物质基础和机制（Liu等人，2020）。当前的TEC框架包括四个核心内容：损伤表型证据（IPE）涉及在模型动物中给予TCM后，检查动物的整体行为状态，并定性和定量地描述动物的毒性行为和毒性表现；有害成分证据（HIE）涉及与毒性结果相关的药物来源成分或物质基础；毒性事件证据（TEE）涉及在毒性过程中获得关键目标、代谢小分子和信号传导的内源性差异；不良结局证据（AOE）涉及对目标器官造成的实质性损害（Kong等人，2022；Duan等人，2024）。
本研究基于毒理证据链（TEC）方法，构建了PPT的TEC框架，并证明了损伤事件与毒性效应之间的动态关系。高通量组学技术的联合应用为全面、多角度的毒性评估提供了指导。转录组学利用高通量测序技术比较正常个体和暴露个体，识别与毒性相关的不同信使核糖核酸（mRNA），并发现PPT心脏毒性的潜在基因组生物标志物。靶向代谢组学使用高度灵敏的检测方法定量分析特定的内源性小分子化合物，并筛选与心脏毒性相关的潜在生物标志物。在本研究中，我们首先确定了暴露于PPT的雄性SD大鼠在表型、血清生化指标、心脏损伤标志物和心脏组织形态方面的变化。随后，利用心脏转录组学和靶向代谢组学方法揭示了转录组特征和花生四烯酸靶向代谢组特征。最后，整合转录组分析、代谢组分析、心肌酶和心脏损伤标志物，以探索PPT的心脏毒性机制。
【结果】
1.PPT诱导的急性心脏毒性 （损伤表型证据：IPE）
图1 雄性SD大鼠的体重、心脏脏器系数及客观表型变化（IPE）. (A) 各组体重比较：展示了不同组别之间大鼠体重的对比情况。(B) 各组心脏脏器系数比较：比较了各组大鼠心脏脏器系数（即心脏重量与体重的比值）的差异。(C) PPT组内24小时行为表现变化：展示了PPT处理组大鼠在24小时内的行为表现变化。(D) 各组行为表现比较：对比了PPT处理组与对照组大鼠的行为表现。数据以均值±标准差（mean ± SD）和中位数±四分位数间距（median ± IQR）表示。与对照组（CON）相比，*p < 0.05表示差异具有统计学意义，**p < 0.01表示差异具有高度统计学意义。
2.血清心肌酶谱指标 、心脏损伤标志物及心脏组织病理表现（不良结局证据：AOE）
图2 PPT在雄性SD大鼠中诱导的心脏毒性（AOE）。(A) 血清心肌酶谱指标：展示了PPT处理对大鼠血清中心肌酶谱各项指标的影响。(B) 心脏损伤标志物：呈现了PPT处理导致的心脏损伤相关标志物的变化。(C) 各组心脏组织病理切片：通过显微镜观察并记录了各组大鼠心脏组织的病理改变。绿色箭头：指示血管充血。黄色箭头：指向不溶性纤维蛋白。蓝色箭头：显示左心室壁心肌细胞胞质疏松，胞质内可见空泡。黑色箭头：标示结缔组织。
3.PPT诱导的 急性心脏毒性转录组分析（毒性事件证据：TEE1）
图3 PPT在雄性SD大鼠中诱导的心脏毒性的转录组分析（TEE1）。(A) 各组火山图：展示了不同组别之间差异表达基因（DEGs）的统计显著性（以-log10(p值)表示）与差异倍数（log2(fold change)）之间的关系。火山图通常用于快速识别具有统计学意义的差异表达基因。(B) DEGs聚类热图：通过颜色深浅表示不同基因在不同样本中的表达水平，从而直观地展示了DEGs在不同组别间的聚类情况。聚类分析有助于识别具有相似表达模式的基因群。(C) DEGs的GO富集分析：对差异表达基因进行了基因本体论（GO）富集分析，以揭示这些基因在生物学过程、分子功能和细胞组分等方面的功能分类。(D) DEGs的KEGG富集分析：对差异表达基因进行了京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，以探索这些基因参与的代谢途径、信号传导通路等生物过程。(E) DEGs的KEGG富集分析及气泡图：除了提供KEGG富集分析的结果外，还通过气泡图直观地展示了富集结果的显著性（以-log10(p值)表示）和富集到的基因数量。气泡图的大小和颜色深浅分别表示富集到的基因数量和富集显著性，有助于快速识别重要的代谢途径和信号通路。
4.PPT诱导的 急性心脏毒性导致花生四烯酸代谢紊乱（毒性事件证据：TEE2）
图4 PPT诱导心脏毒性的花生四烯酸代谢分析（TEE2）。(A) ESI-模式下OPLS-DA的三维得分图。(B) ESI-模式下OPLS-DA的得分图。(C) ESI-模式下OPLS-DA的置换检验。(D) 不同组花生四烯酸代谢物的定量结果。(E) 花生四烯酸代谢途径的差异代谢物。
5. 基因、代谢物、心肌酶和心脏损伤标志物的综合分析（毒性事件证据：TEE3）
图5 差异代谢物、主要差异表达基因、心肌酶和心脏损伤标志物之间的相关性分析
【讨论与结论】
本研究通过评估体重变化、行为改变（IPE）来观察损伤表型变化。同时，通过心肌酶和心脏损伤生物标志物的升高以及组织病理学观察（AOE）来评估不良结局证据。此外，研究还阐述了转录组特征和花生四烯酸代谢谱（TEE）。最终，研究发现PPT导致急性心脏毒性的机制涉及氧化应激、凋亡、炎症反应以及能量代谢紊乱。本研究充分验证了TEC概念用于中药安全性和毒性评价的可行性。它可以成为未来研究其他中药毒性机制的有力工具。
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