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Abstract
溃疡性结肠炎（UC）是一种常见的胃肠道炎症性疾病。在亚洲，传统中医（TCM）长期以来一直被用作治疗溃疡病的方法，而葛根（PR）是一种可靠的止泻疗法。本研究的目的是利用硫酸葡聚糖钠盐（DSS）诱导的UC模型研究PR在小鼠中的保护作用，并确定PR作用的分子机制。通过超高效液相色谱/串联质谱法获得PR的化学成分，并使用网络药理学（NP）方法鉴定潜在的PR和UC靶标，以指导小鼠实验。从PR中共鉴定出180个峰，包括48个类黄酮、46个有机酸、14个氨基酸、8个酚类、8个碳水化合物、7个生物碱、6个香豆素和43个其他成分。NP结果显示，caspase-1是UC相关核心基因中失调最严重的。对DSS治疗的小鼠施用0.136 mg/g的PR剂量可逆转UC小鼠中发现的体质量减轻和结肠长度减少。PR还减轻了肠黏膜脱落、炎症细胞渗透和黏蛋白丢失。PR处理抑制了NOD样受体蛋白3（NLRP3）、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-1（caspase-1）、细胞凋亡相关斑点样（ASC）和GSDMD在蛋白质和mRNA表达水平上的上调。添加小分子双特异性城市磷酸酶抑制剂NSC 95397抑制了PR的积极作用。这些结果表明，PR通过抑制小鼠NLRP3 incl氨小体的激活，对DSS诱导的结肠炎具有保护作用。
Introduction
溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性炎症性肠病，UC的病因涉及环境、遗传和微生物因素。交替的活跃期和缓解期使患者处于结肠炎相关癌症的特殊风险中。此外，为治疗UC而进行的众多药物试验的临床成功有限。在葡聚糖硫酸钠（DSS）模型中为定义UC发病机制而进行的实验表明，焦亡是肠道稳态和黏膜免疫的主要破坏物。细胞焦亡的过度激活促进了炎性细胞因子的过度产生，这些细胞因子激活了免疫系统反应，导致肠上皮细胞结构的破坏并损害了黏膜屏障。
焦亡是一种炎症性细胞死亡，需要炎症小体激活的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-1（半胱天冬酶-1）成熟。NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体是表征最好的胞质NOD样模式识别受体，包括NLRP3、半胱天冬酶-1和细胞凋亡相关斑点样（ASC）蛋白。这三种蛋白质之间的相互作用严格调节炎症小体功能，以确保免疫活性。在免疫激活剂存在下，NLRP3结构松弛，并允许NLRP3和ASC中的pyrin结构域（PYD）之间的相互作用。这允许ASC和procaspase-1的半胱天冬酶募集结构域（CARD）结构域相互作用，从而产生NLRP3炎症小体。这种复合物的形成触发前半胱天冬酶-1自裂解，产生活性半胱天冬酶-1 p10/p20四聚体，并诱导促炎细胞因子白细胞介素（IL）-1β和IL-18从其未成熟前体形式转化为活性分泌形式。活化的半胱天冬酶-1还蛋白水解裂解gasdermin D（GSDMD）以产生促进炎症因子释放的膜孔。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在调节细胞内炎症反应和炎症介质（包括IL-1β）的分泌中起重要作用。MAPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在需要双重磷酸化后激活并被丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（MPK1）抑制。为了保证MAPK信号通路在MAPK抑制剂和LPS处理的NLPR3炎症小体组装中的作用，结果表明LPS介导的NLRP3炎症小体激活的表达部分依赖于MAPK信号通路。因此，有必要找出NLRP3与UC中MAPK信号通路之间的关系。
葛根素是PR的活性化合物，通过调节核因子-E2 p45相关因子2（Nrf2）通路和抗氧化酶，在DSS诱导的UC中显示出抗炎和抗氧化作用。先前的一项研究表明，PR增强了结肠乳酸的产生，并促进了某些有助于抗炎活性的微生物群落的富集。单独使用PR成分大豆苷和3'-羟基大豆苷8-C-芹菜基（1→6）葡萄糖苷表明，作为人RPE细胞中糖化诱导的细胞凋亡的预防剂具有潜在的效用。然而，很少有研究检查PR对UC和细胞焦亡的影响。
本研究采用网络药理学和UPLC-MS/MS方法分析了PR的化学成分和UC的潜在治疗途径。建立DSS诱导的结肠炎模型，研究PR通过NLRP3/caspase-1通路抑制NLRP3介导的细胞焦亡和肠屏障功能的药理活性。
Results
PR水提取物生物活性成分的鉴定
使用UPLC-MS/MS评估PR水提取物的植物化学成分，共鉴定出180个峰（图1）。这些化合物包括48种黄酮类化合物、46种有机酸、14种氨基酸、8种酚类、8种碳水化合物、7种生物碱、6种香豆素和43种其他成分。
PR的网络药理学（NP）分析
采用NP方法，使用SWISS和TCMSP数据库鉴定了120种成分和893个靶标。共选取32个度得分＞2的相关靶点，构建草本-复合-靶点网络（图2A）。该分析发现了451个UC失调蛋白（图2B）。这些数据涉及PR可能通过caspase-1失调基因和MAPK信号转导表现出抗UC作用。
PR改善DSS诱导的小鼠结肠炎
然后使用DSS诱导的结肠炎小鼠模型检查PR对UC的保护作用（图3A）。DSS治疗组的黏膜下浸润炎症细胞的黏膜下细胞数量明显减少（图3B）。此外，慢性UC结肠黏膜中的肠黏蛋白表达显著降低（图3B）。值得注意的是，0.136 mg/g PR缓解了UC小鼠的病理损伤和黏膜损失，而0.068和0.272 mg/g的PR水平没有产生治疗效果。因此，PR 0.136 mg/g用于其余实验。有趣的是，小鼠细胞因子抗体阵列表明，与DSS组相比，SDF-1、TAC-3、BLC、IL-1β、IL-4、IL-9均显著上调（P＜0.01，图3C）。这些结果表明，0.136 mg/g PR可减少炎症并改善DSS诱导的结肠炎。
PR缓解DSS诱发结肠炎的病理变化
接下来评估PR是否缓解了DSS诱导的结肠炎的临床和病理变化。临床上，UC是一种慢性炎症性肠病，通常需要长期药物治疗，以预防以腹泻、便血和结肠长度缩短为特征的疾病相关并发症。DSS小鼠口服0.136 mg/g PR可缓解症状和疾病活动指数（DAI），并显著增加体质量（P＜0.01；图4A和B）。在DSS和DSS＋PR＋NSC 95397组中，结肠长度分别减少了39.9%和37.9%，但PR治疗改善了病理损失（P＜0.01，图4C和D）。同样，PR给药减少了杯状细胞的损失，改善了隐窝结构，减少了炎症细胞的渗透并减轻了黏膜下水肿。PR治疗后肠绒毛的脱落也减少了（图4E）。PR治疗后细胞凋亡也显著下调，双特异性磷酸酶抑制剂NSC 95397治疗逆转了PR的这些积极作用（P＜0.01；图4F和G）。此外，PR治疗显著降低了血清和结肠中IL-1β和IL-18的分泌，但NSC 95397注射抵消了这些治疗效果（P＜0.01；图4H和I）。总之，这些数据表明，PR能够缓解DSS诱导的小鼠UC中发现的一般症状和病理变化。
PR恢复了DSS诱导的结肠炎的肠道屏障
结肠中的上皮内壁调节营养物质运输和宿主防御，对肠道功能至关重要。特别是，黏蛋白层的接近是维持这些功能的主要因素。在用0.136 mg/g PR处理的DSS小鼠中，黏蛋白和紧密连接蛋白黏蛋白-2（MUC-2）和闭合蛋白的表达显著上调（P＜0.01；图5A-D）。UC小鼠中闭合蛋白和MUC-2的mRNA表达水平降低，PR给药抵消了这些降低。进一步证实了一种特定的调控机制，其中NSC 95397消除了PR对UC小鼠的保护作用（P＜0.01；图5E和F）。这些结果表明，0.136 mg/g PR的治疗恢复了DSS诱导的结肠炎中肠道的物理和生物屏障。
PR下调NLRP3炎症小体表达被双特异性磷酸酶抑制剂NSC 95397逆转
进一步研究了PR是否可以改变UC小鼠的NLRP3炎症小体活性。0.136 mg/g PR降低了DSS诱导的ASC、caspase-1、NLRP3和GSDMD的高表达水平，添加NSC 95397（P＜0.01；图6A和B）。这些结果表明，PR抑制了NLRP3组装所需的蛋白质的表达，从而间接降低了NLRP3炎症小体的活化。然而，抑制MPK1去磷酸化活性逆转了这些作用。
PR通过NLRP3/caspase-1通路缓解UC
网络药理学分析表明，caspase-1是UC的核心失调基因，与MAPK信号通路有关。因此，进行了验证caspase-1和MKP-1作用的实验，caspase-1和MKP-1是MAPK级联反应中增殖，分化，焦亡，氧化应激反应性和自噬的调节剂。用NSC 95397抑制MKP1显著抑制MKP1表达（P＜0.01）。PR处理降低UC小鼠caspase-1、NLRP3、ASC和GSDMD的表达，抑制细胞焦亡和炎症（P＜0.01）。然而，用NSC 95397处理后，PR的保护作用被消除（P＜0.01；图7A）。caspase-1、NLRP3、ASC和GSDMD的mRNA水平与PR组显著降低（P＜0.01；图7B）。总之，这些结果表明，PR通过NLRP3/caspase-1信号通路缓解UC。
Conclusion
使用UPLC-MS/MS数据的网络药理学分析确定了PR中存在180种化学成分。PR还改善了UC的DSS模型中的焦亡，并通过减少NLRP3/caspase-1信号传导发挥抗炎和抗焦亡活性。本研究结果为全面了解这种中医疗法治疗效果的分子机制提供了新的见解。
Puerariae Radix protects against ulcerative colitis in mice by inhibiting NLRP3 inflammasome activation
Yu Gaa,b,1, Yuanyuan Weia,b,1, Qingyu Zhaoa,b, Yimeng Fana,b, Yannan Zhanga,b, Zhifang Zhangc, Sijia Haoc, Lixia Wangd, Zhifen Wange, Jinlong Hane, Shuang Wue, Zhihui Haoa,b,*
a Innovation Centre of Chinese Veterinary Medicine, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100086, China
b National Center of Technology Innovation for Medicinal Function of Food, National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing 100193, China
c Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, China
d China Agricultural University Yantai Institute, Yantai 264670, China
e Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China
1 Both authors contributed equally.
*Corresponding author.
Abstract
Ulcerative colitis (UC) is a common infl ammatory disease of the gastrointestinal tract. Traditional Chinese medicine (TCM) has long been used in Asia as a treatment for UC and Puerariae Radix (PR) is a reliable anti-diarrheal therapy. The aims of this study were to investigate the protective effect of PR using the dextran sulfate sodium salt (DSS)-induced UC model in mice and identify molecular mechanisms of PR action. The chemical constituents of PR via ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry and identifi ed potential PR and UC targets using a network pharmacology (NP) approach were obtained to guide mouse experiments. A total of 180 peaks were identifi ed from PR including 48 flavonoids, 46 organic acids, 14 amino acids, 8 phenols, 8 carbohydrates, 7 alkaloids, 6 coumarins and 43 other constituents. NP results showed that caspase-1 was the most dysregulated of the core genes associated with UC. A PR dose of 0.136 mg/g administered to DSS treated mice reversed weight loss and decreased colon lengths found in UC mice. PR also alleviated intestinal mucosal shedding, infl ammatory cell infi ltration and mucin loss. PR treatment suppressed upregulation of NOD-like receptor protein 3 (NLRP3), cysteinyl aspartate-specific proteases-1 (caspase-1), apoptosis-associated speck-like (ASC) and gasdermin D (GSDMD) at both the protein and mRNA expression levels. The addition of a small molecule dual-specifi city phosphatase inhibitor NSC 95397 inhibited the positive effects of PR. These results indicated that PR exerts a protective effect on DSS-induced colitis by inhibiting NLRP3 infl ammasome activation in mice.
Reference:
GA Y, WEI Y Y, ZHAO Q Y, et al. Puerariae Radix protects against ulcerative colitis in mice by inhibiting NLRP3 inflammasome activation[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 2266-2276. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250189.
翻译：林安琪（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片来源：图虫创意
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