《食品科学》：新疆医科大学姚蓝教授等：熊果酸改善高糖诱导的足细胞线粒体功能障碍的作用机制|凋亡|基质|姚蓝|熊果酸|线粒体|蛋白|足细胞|食品科学|高糖

糖尿病肾病（DN）是由糖尿病引起的一种慢性肾脏疾病。目前，早期DN主要通过调节饮食、控制血糖等途径延缓疾病进程，晚期患者主要采用透析和肾移植治疗，这对患者及其家庭造成重大经济负担。

熊果酸（UA）是一种存在于多种中药、水果和蔬菜中的天然五环三萜化合物（图1）。多种药食同源的中药中富含此成分，比如山楂、山茱萸等。UA广泛的生物活性包括改善糖脂代谢紊乱、增强胰岛素敏感性、抗炎抗氧化等，其在糖尿病、肥胖及非酒精性脂肪肝等疾病中已显示出潜在治疗价值。

新疆医科大学中医学院的顾惠贤、阿依夏木·麦提托合提、姚蓝*等拟建立高糖诱导小鼠足细胞的体外DN细胞模型，系统探讨UA对高糖诱导的足细胞线粒体功能障碍、氧化应激及细胞凋亡的保护作用及可能的机制，以期为深入理解足细胞损伤的病理机制及UA防治DN的作用机制研究提供新的视角及理论依据，也为开发基于线粒体功能防治DN的新药和药食同源保健食品提供新的思路。

1 建立体外DN模型和确定给药浓度

为了建立体外DN模型，本实验采用CCK-8法检测葡萄糖对足细胞增殖率的影响。如图2A所示，随着葡萄糖浓度增大，细胞增殖率先升高后降低；当葡萄糖浓度为200 mmol/L时，细胞增殖率约为80%，与对照组比较，显著降低（

＜0.01）。因此采用200 mmol/L的葡萄糖作为体外造模条件。为了筛选UA最佳给药浓度，采用CCK-8法检测UA对HG诱导的足细胞增殖率的影响。如图2B所示，随着UA浓度升高，细胞增殖率先增加后降低。UA浓度为2.813 μmol/L时，细胞增殖率最大，为105.72%，与HG组比较具有显著差异（

＜0.001）。因此后续实验中UA的给药浓度为0.703、1.406 μmol/L和2.813 μmol/L。

2 UA改善HG诱导的足细胞线粒体形态异常

使用线粒体染料Mito-Tracker标记细胞中具有生物活性的线粒体为红色荧光，以评估线粒体形态变化。正常生理状态下，线粒体形态较为完整，多为规则的棒状或椭圆形。由图3可知，相较于CN组，HG组中出现线粒体形态异常，其形状呈不规则且明显碎片化，伴随线粒体数量减少（

＜0.01）。与HG组比较，UA干预后，线粒体形态趋于正常，并且高剂量组改善作用最佳（

＜0.01）。

3 UA抑制HG诱导的足细胞ROS产生

使用DCFH-DA评估HG诱导的足细胞中ROS的产生。DCFH-DA是一种可渗透性探针，可被ROS氧化而呈现绿色荧光。免疫荧光和流式细胞术的结果均显示，相较于CN组，HG组中绿色荧光更强，说明细胞内ROS水平异常升高（

＜0.001）。相较于HG组，UA能显著抑制细胞中ROS水平，其中高剂量组抑制作用最显著（

＜0.01）（图4）。

4 UA抑制HG诱导的足细胞mPTP的开放

使用荧光探针钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein AM）检测HG诱导的足细胞中mPTP的开放程度。Calcein AM可对活细胞染色，通过被动运输进入细胞并在细胞质和线粒体中积累，并被水解为具有绿色荧光的钙黄绿素。正常情况下，mPTP关闭，而CoCl2处理会猝灭细胞质中的绿色荧光，仅保留线粒体内的绿色荧光。细胞在氧化应激或Ca2＋超载刺激下，mPTP开放，钙黄绿素从线粒体释放至胞浆，与CoCl2结合使荧光猝灭；同时CoCl2进入线粒体进一步猝灭残留荧光，导致线粒体荧光强度降低或消失。因此通过荧光强弱可反映mPTP的开放程度。由图5可知，相较于CN组，HG组中线粒体mPTP开放程度显著增加（

＜0.001），表现为绿色荧光减弱，说明HG诱导使足细胞线粒体mPTP开放程度显著增加。相较于HG组，UA能降低mPTP开放程度，表现为绿色荧光显著增强。其中高剂量UA组抑制高糖诱导的足细胞mPTP的开放作用最为显著（

＜0.001）。

5 UA改善HG诱导的足细胞MMP

JC-1是常用于MMP检测的荧光探针。当MMP较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物发出红色荧光。相反，当MMP降低时，JC-1不能在线粒体基质中聚集，此时JC-1为单体并产生绿色荧光。相较于CN组，HG组MMP显著降低（

＜0.001），说明HG损伤足细胞MMP。相较于HG组，低、中、高剂量的UA均能显著升高MMP，其中高剂量的UA恢复MMP的能力最强（

＜0.01）（图6）。

6 UA改善HG诱导的足细胞凋亡

采用流式细胞术分析足细胞凋亡情况。如图7所示，Annexin V-PI染色后，经流式细胞术分析，HG组较CN组足细胞凋亡率显著增加（

＜0.01）。与HG组比，UA不同剂量干预后，足细胞凋亡率显著降低（

＜0.01）。其中高剂量UA抑制HG诱导的足细胞凋亡作用最为显著。

7 UA对HG诱导的足细胞中CypD、VDAC、Bax、Bcl-2、Cyt c蛋白表达的影响

采用Western Blot方法分析足细胞中凋亡相关蛋白水平，如图8所示。与CN组比较，HG组中Cyp D、VDAC蛋白水平显著升高，证明高糖条件下，足细胞mPTP存在持续性开放；与HG组比较，UA给药组中Cyp D和VDAC水平呈不同程度降低，仅高剂量组有显著性差异（

＜0.05）。与CN组比较，HG组Bax和Cyt c蛋白表达升高，Bcl-2蛋白水平显著降低（

＜0.001），说明高糖诱导了足细胞凋亡的发生；干预UA可显著逆转上述凋亡蛋白表达。

DN是一个全球性的健康问题，其病理特征和临床表现复杂多样。DN的组织病理学特征主要包括肾小球基底膜增厚、系膜细胞增生、肾小球硬化、肾小管间质纤维化以及足细胞损伤等。足细胞是不可增殖的终末分化细胞，其损伤会导致足突融合、足细胞数量减少以及肾小球滤过屏障功能受损。此外，足细胞损伤与氧化应激密切相关。氧化应激可以直接损伤足细胞结构，或者通过激活凋亡信号通路、加剧炎症反应，导致细胞凋亡、细胞焦亡、铁死亡、坏死性凋亡等，这些病理变化导致肾功能改变，使临床DN患者表现为GFR下降、肌酐升高、持续性蛋白尿、肾功能下降等。

线粒体作为细胞的动力源，同时也是产生ROS的主要场所，ROS主要包括超氧阴离子自由基、过氧化氢、羟自由基、单线态氧、过氧亚硝基阴离子等。长期高血糖环境下，细胞内能量供应形式发生转化，其表现为葡萄糖通过元醇途径转化为山梨醇和果糖，通过消耗细胞质中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和谷胱甘肽触发氧化应激损伤。糖代谢异常引发晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）不断累积，与肾脏中AGEs受体结合激活多种信号通路，导致足细胞中ROS过度产生。AGEs诱导的ROS增加不仅损伤足细胞结构，还会通过激活NLRP3炎症小体，诱导炎症因子释放，进一步加重足细胞损伤。此外，细胞线粒体产生ATP过程中，由于高糖的刺激导致电子传递链受损，使得过多的电子泄漏，与分子氧结合形成超氧化物（包括超氧阴离子自由基、过氧化氢、羟自由基），ROS产生增多。过多的ROS积累而抗氧化防御机制的失衡，导致氧化应激水平升高，进而诱发足细胞凋亡。细胞中ROS的增加，一方面导致MMP丧失、线粒体形态碎片化，阻碍ATP生成和细胞能量代谢，进一步加剧ROS的生成及细胞氧化应激损伤。另一方面，线粒体功损伤又导致线粒体中过多Cyt c释放，激活Caspase-3等凋亡相关蛋白，最终引发足细胞凋亡。本研究发现，高糖诱导下足细胞ROS含量明显高于对照组，说明高糖导致了足细胞氧化应激损伤，UA干预后ROS显著减少，说明UA具备抗氧化的能力。CCK-8实验及流式细胞实验结果证实了UA能显著改善HG诱导足细胞凋亡，且具有促进足细胞增殖的作用，但确切的作用机制有待于进一步研究。

研究表明，DN发病进程中，代谢紊乱引发的氧化应激导致线粒体功能障碍，参与足细胞凋亡过程。足细胞线粒体功能障碍表现为线粒体形态改变、MMP丧失、mPTP过度开放、ROS积累、ATP生成减少、线粒体DNA释放等。线粒体是经典的细胞程序性死亡执行细胞器，线粒体介导的凋亡是通过mPTP过度开放实现的。mPTP是位于线粒体内膜和线粒体外膜之间的非特异性通道，由Cyp D和VDAC等关键蛋白组成。Cyp D是亲环素家族中的一员，主要调节mPTP开放、线粒体钙稳态、线粒体能量代谢，参与细胞死亡进程。Cyp D通过调控mPTP的开放状态，在细胞坏死和凋亡过程中发挥重要作用。VDAC是一类位于线粒体外膜上的膜蛋白，其功能包括转运代谢物和离子、维持线粒体稳态、调控细胞凋亡等。过量的ROS直接触发mPTP异常开放，这允许分子质量小于1.5 kDa的溶质流入线粒体基质，使线粒体膜通透性增加、线粒体肿胀、MMP去极化、线粒体膜间空间蛋白Cyt c释放，相关凋亡因子（Bax、Bcl-2）被激活，最终结局为细胞凋亡。本研究发现，高糖刺激下足细胞中线粒体形态异常，线粒体呈圆形且明显碎片化，mPTP开放程度显著增加，表明线粒体结构和功能受损；Cyp D和VDAC表达上调，意味着mPTP开放程度更强。UA能显著恢复线粒体形态，抑制mPTP的异常开放及相关蛋白Cyp D和VDAC表达，说明UA可以恢复HG诱导下足细胞氧化应激触发的线粒体功能障碍。MMP的去极化是线粒体功能障碍的关键指标之一，也是启动细胞凋亡的关键步骤。MMP的稳定是维持正常的细胞生理过程、维持线粒体氧化磷酸化以支持高效的ATP生产的关键因素。然而，当细胞受到各种应激刺激时，例如氧化应激、Ca 2＋过载、线粒体DNA损伤、药物或化学物质时，MMP发生去极化。MMP的去极化通过线粒体外膜透化过程触发了关键的促凋亡因子Cyt c释放到细胞质中，Cyt c与凋亡蛋白酶激活因子1结合形成凋亡小体。凋亡小体激活Caspase-9，进而激活下游的Caspase-3。Caspase-3可切割多种细胞底物，是细胞凋亡的关键蛋白。Bcl-2和Bax是内源性细胞凋亡的关键信号分子，分别发挥抗凋亡和促凋亡作用。当接收到凋亡刺激信号后二者易位至线粒体膜上并形成二聚体，进一步增加线粒体膜的通透性，进而激活Caspase级联反应。故调节Bcl-2和Bax之间的平衡是决定细胞命运的关键。此外，研究表明，Bcl-2蛋白能够调控MMP，其阻止MMP去极化而保护细胞免于凋亡。本研究发现，高糖刺激下足细胞MMP去极化，说明线粒体功能受损；Bcl-2表达减少，Cyt c和Bax表达增多。UA干预恢复了MMP，逆转凋亡蛋白的表达，说明UA可能通过恢复HG诱导足细胞mPTP过度开放及MMP，改善足细胞线粒体功能障碍，进而延缓足细胞凋亡。

综上所述，本研究通过体外实验探讨了UA对于高糖诱导的足细胞线粒体功能障碍及凋亡的影响。结果表明：UA能够通过阻止足细胞氧化应激，改善足细胞线粒体功能障碍和细胞凋亡，延缓DN的发生发展。本研究为DN的治疗途径及对DN发病机制的认识提供了一种新的思路。靶向线粒体功能的系列药物已在临床中广泛用于各种疾病的治疗。例如：线粒体靶向抗氧化剂MitoQ可通过增强葡萄糖转运蛋白4易位和改善骨骼肌细胞线粒体功能障碍减轻胰岛素抵抗进而改善肥胖；另一种线粒体靶向药物SkQ1滴眼液已完成II期临床试验，其能显著清除角膜细胞线粒体ROS，提高泪膜稳定性改善干眼症；Ebselen是美国食品药品监督管理局批准的新型抗炎药，多项II期临床试验已证明其治疗急性噪声性听力损失的安全性和有效性。近期研究发现Ebselen可能通过改善神经胶质细胞线粒体功能损伤，改善阿尔茨海默病患者的认知功能障碍。因此认为靶向线粒体可能成为治疗DN的有效途径之一。而本研究针对靶向足细胞线粒体功能改善作用的天然化合物UA防治DN的可能作用机制进行了初步的探索，为防治DN药物筛选及疾病机制研究提供了可行的思路和方法。然而本研究基于体外细胞实验展开，确切的作用仍有待于体内实验的进一步研究和验证。

作者简介

通信作者：

姚蓝，博士、教授，硕士研究生导师中医学院中药药理学教研室主任。主要从事中药复方及新疆地产药用资源药理作用研究。主持国家自然科学基金1 项、自治区自然科学基金1 项、高校科研计划项目1 项、主持产学研横向课题2 项，在国内核心期刊中发表论文69 篇，SCI论文5 篇。累积影响因子20 分，他人引用频次654 次。2021年度获“华夏医学科技奖”，三等奖排名第六。2024年获自治区科技进步一等奖排名第七。授权发明专利1 项、实用型新专利2 项。

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