在抗体药物研发、诊断试剂开发和基础免疫学研究中，抗体亲和力（通常以解离常数 KD 表示）是评估抗体活性与功能的核心指标。高亲和力抗体通常具有更强的靶标结合能力，可提高抗原识别效率，并有助于提升抗体在治疗和检测应用中的性能表现。如何实现高通量、快速检测亲和力，已成为抗体筛选和发现的基本需求。
贝勒医学院下一代疗法研究中心主任王津教授在ACS Medicinal Chemistry Letters期刊发表了题为：Evaluation of High Affinity Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug Conjugates by Homogenous Time-Resolved FRET 的研究论文。该研究建立了一种竞争型TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）检测方法，可对结合共同抗原的抗体药物进行相对亲和力排序，并展示了该方法在抗体-药物偶联物（ADC）工艺和样本处理条件评价中的应用。
TR-FRET将荧光共振能量转移与时间分辨荧光检测相结合。当供体与受体足够接近时（7-10 nm），供体被激发后可发生荧光共振能量转移。检测特定波长的信号比值即可确定待测物含量。TR-FRET 技术均相、免洗，兼容自动化操作，无需对分析物进行任何修饰，最低可评估低至个位数皮摩尔级别的亲和力。
在竞争型TR-FRET检测方法中，研究人员以 AF488 标记的曲妥珠单抗 Fab´ 片段、带 His 标签的 HER2 重组胞外结构域（ECD）蛋白和 Tb 标记的 His 抗体构建检测体系。 Fab´ 与 HER2 结合后，使荧光供体 Tb 与受体 AF488 接近，产生 TR-FRET 信号。加入待测单抗或 ADC 后，待测分子与 Fab´ 竞争结合 HER2，信号随竞争置换降低。通过待测分子的浓度梯度和竞争曲线拟合，可获得表观平衡抑制常数 KI，用于比较样本的相对结合强度。
竞争型 TR-FRET 检测原理
研究人员主要从方法学验证、性能确认、方法优化以及 ADC 检测等多个方面进行了分析。结果发现，竞争型 TR-FRET 方法可以避免钩状效应导致的假性结果。“钩状效应（Hook Effect）”容易在 SPR（直接法）、ELISA 等实验中出现。随着抗原浓度升高，抗原-抗体复合物大量形成，检测信号反而下降，导致剂量曲线出现拐点，产生常见的 I 型（假阳性）或 II 型（假阴性）错误结果。
直接结合与竞争检测模型所得速率常数的比较
研究人员以 HER2（曲妥珠单抗）为体系，在 4℃ 条件下完成方法学验证。方法依赖于能够与待测抗体竞争结合抗原的标记探针，需选择高亲和力、性能稳定的 Fab 或纳米抗体等探针。为稳定复合物的高亲和力，所有实验需在 4℃ 进行，且平衡时间长达 18-40 小时。而 SPR 通常在室温或接近生理稳定下进行，孵育时间通常为 1-2 小时。
研究人员认为应优化标记探针、抗原及辅助检测抗体的浓度范围，并设置背景和非特异性结合对照。供体淬灭等光物理干扰也可能改变信号，需在方法开发中加以评估，避免将荧光信号变化直接解释为结合活性变化。
总的来说，该研究进一步证实 TR-FRET 在抗体亲和力研究中的优势。TR-FRET 检测在溶液相中完成，无需将待测抗体或抗原固定于固相，也无需复杂的样本前处理或洗涤。微孔板形式便于自动化移液和并行检测，可扩张性强。与 SPR、BLI 等固相技术相比，更容易实现“移液即读”的高通量筛选。
TR-FRET 通过延迟检测长寿命的荧光信号，降低了背景干扰和信噪比。但时间分辨检测不能完全排除荧光淬灭等干扰，仍需结合试剂浓度优化和对照进行判断。TR-FRET 检测所需的仪器已非常普及，比如多功能酶标仪，可适配抗体研究领域快速增长的使用需求。实验操作较简单，成本可控，不仅可用于初筛阶段的大规模筛选，还能用于抗体类药物生产环节的质量控制。
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论文链接：
https://doi.org/10.1021/acsmedchemlett.4c00317
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