事实证明，疫苗接种是控制动物病原体的有效手段。自 19 世纪引入兽用疫苗以来，已开发出几代疫苗。这些疫苗对全球动物健康和生产产生了积极影响。尽管兽用疫苗取得了成功，但仍有一些病原体尚无有效的疫苗，例如非洲猪瘟。此外，动物健康不断受到新出现和重新出现的病原体的威胁，其中一些是人畜共患的，可能对人类健康构成威胁。严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) 大流行凸显了对安全有效的新疫苗平台的需求，但同样重要的是，这些疫苗平台应具有适应性，可以快速修改以匹配传播的病原体。mRNA疫苗已被证明是针对各种病毒和细菌病原体的有效疫苗平台。本文将介绍兽用 mRNA 疫苗领域的一些最新进展。此外，本文还将讨论各种mRNA疫苗及其递送方法，以及已报道的疗效。此外，本文还将讨论该疫苗平台在兽医领域的当前局限性和未来前景。
简介
新发和复发的病毒性疾病导致大流行的持续威胁日益加剧。COVID-19 疫情凸显了对可放大、快速开发且低成本疫苗的迫切需求，以控制未来的卫生紧急情况。mRNA疫苗有可能适应最新传播的病毒变异株。与传统疫苗相比，mRNA疫苗的这一特性使其成为控制可能引起流行病或大流行的新兴病毒的更佳候选疫苗。
诱导持久的细胞和抗体介导的免疫反应对于有效控制新发病原体至关重要。mRNA 的给药会导致抗原的短期产生及其在细胞质中聚集。与自然感染类似，抗原肽被转运至有核细胞表面，由主要组织相容性复合体(MHC)-I 分子呈递。该胞质途径可诱导细胞毒性 T 淋巴细胞(CTL)。另一方面，编码抗原的分泌和循环利用会激活MHC-II 通路。
mRNA 被递送至常规细胞（例如肌肉细胞）后，会通过核糖体直接翻译成蛋白质（抗原）。这些蛋白质经过蛋白酶体加工，然后装载到细胞表面的 MHC-I 上、进行膜锚定，或释放到细胞外空间。肽在MHC-I 上的呈递会激活CD8 + T 细胞。分泌到细胞外或进行膜锚定的病毒蛋白会被 B 细胞感知，并引发抗体依赖性应答。在吸收分泌的病毒蛋白后，肽会通过 MHC-II 呈递到抗原呈递细胞(APC) 上。该途径将触发 CD4 + T 细胞应答，这对于启动抗体介导的应答也至关重要（图 1）。
图 1. 细胞摄取后包裹 mRNA 的 LNP 的细胞内通路示意图。注射后，(1) LDL 受体通过 ApoE脂蛋白与 LNP 相互作用。然后，颗粒停留在内体中 (2)，由于 pH 值下降，阳离子脂质带电，这有助于破坏内体膜。然后，核糖体开始翻译mRNA 分子并产生病毒抗原(3)。病毒抗原通过蛋白酶体降解(4)，MHCI 分子将表位呈递给 CD8+ T 细胞 (5)。病毒抗原也可以由 MHC II 分子呈递以激活 CD4+ T 细胞(6)。完整的疫苗蛋白将被 B 细胞感知，从而产生针对该特定抗原的抗体介导反应。
mRNA疫苗在兽医领域的应用
口蹄疫（FMD）
迄今为止，已经研究了几种兽用 mRNA 疫苗。2009 年，报道了针对猪口蹄疫病毒 (FMDV) 的 RNA 免疫。单次免疫 500 µg 全长嵌合 O1K/C-S8 RNA 可诱导细胞介导和抗体介导的免疫反应。Pulido等人给小鼠接种了低剂量和高剂量的 FMDV转录本，这些转录本编码的病毒突变体分别删除了病毒 RNA的两个茎环结构。接种后 15 天，几乎 60 % 的动物表现出对 FMDV 的显著中和抗体反应。本研究中较高的 RNA 剂量并不一定会导致更高的中和抗体浓度。此外，低剂量组小鼠中70%的中和抗体浓度较高。相比之下，高剂量组小鼠中只有不到50%的中和抗体浓度可检测到。经口蹄疫病毒（FMDV）攻击后，抗体检测呈阳性、病毒检测呈阴性的小鼠被认为受到保护（38%）。受保护小鼠的FMDV抗体浓度比mRNA免疫后第15天测得的抗体浓度高出3倍。
波瓦桑病毒（POWV）
2018 年，一种以脂质纳米颗粒递送的 mRNA疫苗被证明具有保护作用，该疫苗编码了波瓦桑病毒(POWV)的 prM 和 E 基因，波瓦桑病毒是一种感染鹿的新型蜱传黄病毒。小鼠肌肉注射10 µg mRNA。免疫 28 天后使用相同剂量作为加强针。加强针四周后，用两种 POWV 毒株对小鼠进行攻击。所有接种疫苗的小鼠均存活，而安慰剂组100% 的小鼠在这次致命攻击后死亡。此外，在感染前一天将接种疫苗的小鼠的血清被动转移至未接种疫苗的小鼠可保护 100% 的接种者。此外，据报道，本研究中疫苗诱导的免疫反应可产生针对Langat 病毒和其他蜱传黄病毒的交叉反应抗体介导的应答。
伪狂犬病毒（PRV）
一种针对伪狂犬病毒(PRV)的 mRNA 疫苗最近已在小鼠中进行了测试。该疫苗基于糖蛋白D (gD) 设计，并在免疫后监测了八周的抗体反应。在第四周检测到最高的特异性 IgG 和中和抗体浓度，并且在间隔 14 天的加强针后，PRV 特异性中和抗体的浓度得到增强。接种组还显示血液来源的单核细胞中干扰素 (IFN)-γ和白细胞介素 (IL)-2 等细胞因子显著上调。与对照组相比，接种组血液中的 CD4 + /CD8 + T 细胞比率更高。然后用 PRV 攻击免疫的小鼠 (n=15)，并评估动物的临床症状、体重减轻和 15 天的存活率。绝大多数（95%）接种疫苗的小鼠保持健康，而所有对照组小鼠均死亡。
猪流行性腹泻（PED）
一种针对由冠状病毒科成员猪流行性腹泻病毒引起的猪流行性腹泻 (PED) 的 mRNA 疫苗已被证明是有效的。猪地方性腹泻病毒是一种肠道致病病毒，其囊膜上包含一个刺突 (S)糖蛋白。S蛋白在与宿主细胞受体结合方面起着关键作用，并含有许多诱导中和抗体产生的受体。针对 PED 的RNA 疫苗是第一个获得许可用于控制 PED 病毒的源自alphavirus的复制子RNA 颗粒疫苗。该疫苗采用复制子载体系统，利用委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)，在猪细胞内有效运输和扩增 PED 病毒 S 糖蛋白抗原。该mRNA疫苗在母猪体内诱导产生中和抗体，并在哺乳仔猪体内被动获得抗体。研究结果进一步表明，受攻毒仔猪病毒脱落减少，受攻毒母猪分娩死亡率降低。
禽流感病毒
一项关于鸡禽流感疫苗的研究使用了蛋白包被的壳聚糖纳米颗粒（CNP）包装的mRNA疫苗。测试了三组疫苗：a) 含有HA2-HA1和M2e抗原mRNA且表面带有蛋白质的CNP（CNP+RNA+Pr）；b) 表面带有蛋白质的空CNP（CNP+Pr）；以及c) 空CNP。第二剂疫苗接种后，接种疫苗的鸡接受H7N9或H9N2病毒攻击。与其他组相比，CNP+RNA+Pr疫苗的效果最为理想，病毒载量更低，病毒源性病变减少，免疫应答更强。具体而言，在CNP+RNA+Pr组中观察到HA2特异性IgY和IgA水平更高，病毒中和滴度（VNT）也增强。此外，该研究还强调了针对 HA2-HA1 抗原的显著 CD4+ T 细胞反应。
狂犬病
在最近的一项研究中，Stokes 等人采用了一种自扩增 mRNA 疫苗技术，用于对抗大鼠狂犬病毒。该疫苗以编码狂犬病糖蛋白 G 的甲病毒基因组为靶抗原构建。该疫苗以大鼠肌肉注射的方式进行，共注射四次，每次间隔两周。结果显示，在注射部位和引流淋巴结中存在狂犬病糖蛋白 RNA（用于疫苗设计），其水平随时间推移而降低，但最迟在第60 天仍可检测到。狂犬病糖蛋白 RNA 也在血液、肺、脾和肝脏中短暂存在。该疫苗被证明可有效诱导抗体介导的免疫反应。接种疫苗后第46天，接受治疗的小鼠的狂犬病毒特异性抗体水平（IgG）显著升高，即使在第71天的恢复期后也持续存在。抗体在恢复期后仍持续存在，表明该疫苗具有诱导持续长期免疫反应的潜力。总体而言，结果表明狂犬病mRNA疫苗在大鼠体内耐受性良好，支持其临床开发的潜力。
牛呼吸道合胞病毒
美国农业部正在进行一项研究，旨在开发一种针对牛呼吸道合胞病毒 (RSV) 的新型 mRNA 疫苗系统。RSV是一种重要的病毒病原体，会影响犊牛，并导致呼吸道疾病综合征。RSV免疫力持续时间短，传统的蛋白质疫苗在现实农场环境中，由于存在各种应激源和共传播病原体，效果可能不佳。为了解决这些问题，一项研究旨在寻找一种经济高效的 mRNA 疫苗系统，该系统可能产生更热稳定的转录本，适合农场免疫接种。
非洲猪瘟（ASF）和古典猪瘟（CSF）
美国农业部正在进行的另一个项目包括开发自扩增mRNA纳米颗粒技术，用于治疗猪非洲猪瘟（ASF）和经典猪瘟（CSF）。mRNA插入片段源自TC-83甲病毒的非结构基因。该疫苗平台将包含表达20种病毒蛋白的转基因序列，包括非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪瘟病毒（CSFV）或两种病毒蛋白的组合。
猪流感病毒
针对猪流感的mRNA 疫苗的构建和使用已经有了显著的改进。默沙东动保提供了第三代RNA 颗粒技术“SEQUIVITY”，该技术能够根据需要针对不断进化的病毒和细菌病原体生产针对特定畜群和菌株的 RNA 疫苗。该平台使用源自 VEEV TC-83 疫苗株的α病毒复制子载体系统生产了 SEQUIVITY®猪流感病毒疫苗(SWV)。该疫苗此前已被证明可在小鼠和猪中诱导强烈的抗体和细胞介导的免疫反应。此外，该平台提供了定制疫苗的灵活性，可实现针对特定畜群的配方。H3N2 RNA 疫苗的免疫原性和有效性试验表明，在加强接种后三周内可产生保护性血凝抑制反应，随后产生抗原特异性 IFN-γ反应，从而最大限度地减少鼻腔脱落，并减轻猪的临床 SIV 疾病。
加拿大食品检验局 (CFIA) 的加拿大兽用生物制品中心(CCVB)最近批准在加拿大全国范围内使用针对猪流感病毒(SIV) 的 RNA 疫苗。SIV 疫苗的预期用途涉及在兽医处方和监督下的特定农场，其中将选择来自受感染场所的SIV 血凝素(HA) 基因序列来开发农场/菌株特异性 SIV 疫苗，该疫苗封装在源自 VEEV TC-83 疫苗株的病毒样 RNA 复制子颗粒 (VRP) 中。值得注意的是，VRP 缺乏产生其结构蛋白的遗传成分，导致其繁殖缺陷。这种渐进式方法与默沙东动保商业猪流感疫苗（USDA 产品代码 19A5.D0，CCVB 文件 880VV/S3.0/H16）一致。默沙东的商业 SIV 疫苗含有来自美国中西部的Clade IV H3N2 SIV 临床分离株的 HA 基因。基于 VEEV 的 VRP 之前已在豚鼠、大鼠、兔子、牛、恒河猴、食蟹猴和人类身上进行过测试，没有不良反应。在六周龄猪中，商业 SIV 疫苗已成功以 50 倍更高的剂量进行测试。主要剂量通过肌肉注射，而另一剂量同时通过静脉注射。结果表明，在接种疫苗和接触疫苗的猪中，接种疫苗后第 3、7、10、14 天的直肠和鼻拭子样本中没有复制的 VRP。同样，接种疫苗的猪表现出血清转化滴度，而接触猪均未表现出抗HA抗体，这进一步支持了疫苗无法从接种疫苗的猪传播给接触猪的观点。接种疫苗后未报告任何不良事件。
马立克氏病病毒（MDV）
马立克氏病病毒 (MDV) 是一种致癌性、鸡高度传染性的甲型疱疹病毒。研究团队最近开发了一种二价 mRNA 疫苗，该疫苗编码了 MDV 的糖蛋白 B 和磷蛋白 38 抗原，并负载于脂质纳米颗粒中。为了评估该疫苗的有效性，研究测量了MDV 基因组载量、病变评分（发生肿瘤病变的器官数量）、肿瘤发生率和细胞因子表达。
与对照组相比，两次接种 10 μg mRNA（间隔十四天）的疫苗显著降低了肿瘤发生率、平均病变评分、法氏囊萎缩和羽毛尖端的 MDV 负荷（图 2）。
图 2 . mRNA 疫苗从设计到免疫反应的示意图。（1）将靶抗原最新序列的 RNA 构建体用递送装置（例如脂质或壳聚糖纳米颗粒）封装。在接种疫苗之前，对含有 mRNA 的纳米颗粒进行大小、电荷、细胞摄取和蛋白质表达评估。（2）mRNA 疫苗已在人类、小鼠、鸡、猪和牛等不同物种中进行了测试。人和动物的 mRNA 疫苗接种均能诱导针对各种病毒的有效免疫反应。（3）已证明 mRNA 疫苗接种可诱导抗体和细胞介导的免疫反应。细胞摄取后，模式识别受体会感知 mRNA ，从而释放I 型干扰素和促炎细胞因子。利用细胞机制，mRNA代码将被翻译成靶抗原。疫苗蛋白将被释放到细胞外空间或呈递到 MHC-I 或/和 II 分子上。完整的蛋白质将被 B 细胞感知，从而产生抗体介导的反应，而 MHC 分子上的肽呈递会激活 CD4 和 CD8 T 细胞。
mRNA疫苗的潜在问题
尽管RNA疫苗在快速灵活的设计和开发方面优于现有疫苗，但仍需注意一些挑战。RNA不稳定性、过度的炎症反应、剂量以及体内递送效率低下等问题需要进一步考虑和改进。
未受保护的 RNA 极易被细胞外RNase降解。为了解决这个问题并确保有效的 RNA内化，人们设计了各种试剂来促进 mRNA递送至细胞质。添加 5' 帽并在 5′和 3′非翻译区两侧添加可稳定 mRNA序列并延长其半衰期。建议添加理想长度的poly(A) 尾以增强 mRNA 构建体的稳定性和翻译能力。高鸟嘌呤和胞嘧啶含量是另一种与体外恒定 mRNA 浓度和体内蛋白质表达相关的修饰。
疫苗接种后，外源性mRNA被各种先天免疫受体识别后，表现为病原体相关分子模式（PAMP）。外源性RNA的这种免疫刺激特性可以被认为是一把双刃剑。佐剂通常与疫苗联合使用，以启动和增强促炎状态，促进树突状细胞（DC）成熟，从而激活更强烈的适应性免疫反应。mRNA的这种佐剂样特性促进了这种途径。然而，先天免疫系统对mRNA的识别可能导致抗原呈递缺陷和不适当的免疫反应。为了解决这些问题，修饰核苷如假尿苷和1-甲基假尿苷已经被开发并用于基于修饰mRNA的治疗领域。
与基于 mRNA 的疫苗和其他基于 RNA 的疗法相关的另一个担忧是体内递送不足。在这方面，已经提出了体外装载 DC、机械（枪）和结内注射等方法。由于这些方法的复杂性和相关成本，它们并不广泛适用。因此，仍然需要一种既能诱导有效的免疫反应，又能保证裸露的 mRNA 安全且不被降解的方法。与体内递送相关的问题之一是剂量。疫苗剂量不理想会导致免疫反应不足。另一方面，过量给药可能会因纳米颗粒在肝脏蓄积而导致毒性，此外还会导致过度的免疫反应和/或诱导免疫系统的效应细胞产生耐受性。
外源mRNA的耐受性、稳定性、生物分布和消除在动物体内可能存在差异。例如，Tahtinen等人最近的一项研究表明，小鼠和人类对等剂量mRNA疫苗的反应不同，小鼠可以耐受高出1000倍的mRNA相对剂量（按体重计算）。
据我们所知，尚未在接种mRNA疫苗的动物的牛奶、肉类或蛋类中检测或报告mRNA疫苗的存在。另一方面，大多数动物源性食品产品，例如牛奶、肉类和蛋类，都会经过灭菌或烹饪处理，这会导致任何mRNA残留物完全降解。此外，接种mRNA疫苗的食用动物将被要求停药，这消除了动物产品中存在残留的可能性。总体而言，兽用mRNA疫苗被认为是安全的，因为它在动物体内具有更高的耐受性，并且在食品加工过程中任何mRNA残留物都会完全降解。
mRNA疫苗在兽医领域的未来前景
mRNA 疫苗在人体临床应用中的成功为兽医领域的 mRNA疫苗平台打开了大门。病毒感染仍然是畜牧业和家禽业的持续威胁。提高 mRNA 疫苗效力的一个潜在策略是使用嵌合体序列来诱导免疫反应。嵌合体疫苗包含来自各种病毒变体（例如 HIV）的成分，将它们混合在一起以诱导更广泛的免疫反应。例如，使用含有 GP5 嵌合体序列的DNA 疫苗来对抗新出现的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 变体，已证明其对猪体内流行的PRRSV 毒株的病毒攻击具有免疫保护作用。强调在 mRNA疫苗框架内从新出现的毒株中创建合成嵌合体抗原的想法可能会提供更广泛的免疫反应。
此外，非侵入性递送途径，例如鼻内和气雾剂给药，越来越受到动物疫苗的青睐，以尽量减少与疫苗接种程序相关的压力、疼痛和成本。Su等人和Jansen 等人的研究强调了在小鼠中使用非侵入性 mRNA 疫苗递送方法，包括鼻内和肺部给药（液体和粉末形式）作为mRNA 疫苗的替代递送途径。2022 年，Abramson等人测试了一种在猪中口服核酸治疗剂的新方法，即自定位毫米级涂药器 (SOMA) 药丸。每粒药丸含有 50 μg（80 mL）编码Cre 重组酶的 mRNA ，并用纳米颗粒包裹。研究人员合成并筛选了一系列支链杂化聚（β-氨基酯）mRNA纳米颗粒，并将其与可吞咽的毫微注射胶囊结合，直接递送至胃组织。这项研究证明了mRNA在小鼠和猪的胃黏膜细胞中的蛋白质翻译以及全身摄取。利用自定位SOMA药丸，他们实现了药物精准递送至胃组织的血管化层，从而绕过了胃肠道中的降解酶。
在兽医领域通过mRNA疫苗接种进行有效的疾病控制可以通过两种主要方式直接影响人类和公共健康：a）控制动物种群中新出现和重新出现的人畜共患病原体，以防止传播给人类，b）通过对食用动物进行有效的疫苗接种，维持人类粮食的可持续性，并防止在动物中爆发病毒/细菌疫情后出现粮食不安全的情况。
结论
关于RNA疫苗有效性的报告正在迅速积累，所有报告一致认为，这项新技术有可能产生针对不同病毒和细菌病原体的有效免疫反应。快速的研发速度、低成本和安全性是这类疫苗的一些关键优势。mRNA疫苗可作为兽医领域一个安全且前景广阔的平台。通过mRNA疫苗诱导针对多种家禽、牛和猪病毒的免疫力，可以预防新发病原体的流行病、动物流行病和大流行，并有助于实现可持续的粮食体系。
原文：F. Fazel, J. S. Doost, S. Raj, et al., The mRNA vaccine platform for veterinary species. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2024.
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