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Introduction
克罗诺杆菌隶属肠杆菌科，是一种食源性致病微生物。近年来，克罗诺杆菌被划分为7 个种和3 个亚种，其中阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌是临床的主要致病菌，可引起婴幼儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎等严重疾病。婴儿配方奶粉（powdered infant formula，PIF）是其主要的污染途径之一，加工环境是重要的污染源。因此，世界粮食及农业组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）将克罗诺杆菌属列为PIF A类致病菌。由于克罗诺杆菌具有较强的环境适应性，在全球乳制品行业中的污染事件不断发生。因此，迫切需要对克罗诺杆菌的环境耐受性进行研究，分析其耐受性机制，为PIF及食品行业的安全保障奠定理论基础。
研究发现克罗诺杆菌可存在于各种干制品中，尤其是PIF，且污染范围广泛。克罗诺杆菌比大多数肠杆菌科其他菌种具有更强的抗干燥和抗渗透压能力，使其能够在极低水分活度的PIF中长期存活。且奶粉培养基中的克罗诺杆菌比缓冲液中的克罗诺杆菌具有更高的耐干燥性，这可能是由于牛奶中的某些蛋白质和乳糖可以包裹克罗诺杆菌菌株，从而在干燥胁迫下保护细菌。
研究表明，在干燥条件下克罗诺杆菌可通过基因调控在细胞内积累钾离子、谷氨酸等电解质，增加细胞内渗透压，从而适应细胞外干燥条件造成的高渗透环境。此外，克罗诺杆菌可能通过积累海藻糖和甜菜碱等保护性多羟基化合物来增强其对干燥条件的抵抗力。另一种理论认为，能够产生生物膜的克罗诺杆菌对干燥的抵抗力更强。近年来，一些与干燥和渗透耐受性相关的基因已被确定，但其抵抗干燥和渗透压的机制还没有得到充分的研究。
因此，宁波大学付世骞，东北农业大学杨鑫焱副教授和姜毓君教授等以分离自PIF的35株克罗诺杆菌为研究对象，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption ionization time of flight massspectrometry，MALDI-TOF MS）进行菌种鉴定，并对所有菌株进行了耐干燥性和耐渗透性评价，同时分析了分离株的生物膜形成能力。进而分别选取两种条件下最具代表性的菌株进行转录组测序，挖掘克罗诺杆菌在干燥和高渗透压条件下的相关基因和调控途径。
Results and Discussion
35 株分离株的MALDI-TOF MS鉴定结果与16S rRNA鉴定结果一致，表明MALDI-TOF MS鉴定能有效区分克罗诺杆菌属。分离株所属的阪崎克罗诺杆菌（C. sakazakii）、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌（C. malonaticus）、苏黎世克罗诺杆菌（C. turicensis）和都柏林克罗诺杆菌（C. dublinensis）四个标准菌株的质谱如图1a所示。其中，C. sakazakii和C. malonaticus的质谱图离子峰最为接近，离子质荷比m/z在2 690、4 364、5 380、6 255、7 275、9 475和10 284附近均出现1 个离子峰，而C. malonaticus又在m/z 11 472和12 658附近各出现1 个离子峰。MALDI-TOF MS结果的聚类分析如图1b所示，在参考了分离株所属4 个种的标准菌株的基础上，克罗诺杆菌分离株被分为4 个大簇，属内不同种的菌株能够被清晰地区分开，各个种内不同的分离株也能够进行有效的聚类和区分，说明MALDI-TOF MS分型的辨识度较高。
图1 (a) 四株标准菌株的质谱图；(b) 基于质谱数据的克罗诺杆菌分离株聚类分析
菌株耐干燥情况如图2a所示，不同克罗诺杆菌的耐干燥程度有所差异，受试分离株在相同干燥条件下的失活率在9.01%~77.57%。其中，干燥条件下具有较强耐受性的菌株为CS21（ST199）、CS19（ST83）、CS10（ST23）、CM3（ST7）和CS20（ST198），所对应的致死率分别为9.01%、15.11%、20.12%、23.81%和24.75%。最不耐干燥的菌株为CS5（ST12）、CS15（ST50）和CM16（ST60），致死率均超过75%。经统计，干燥失活率低于50%的克罗诺杆菌共有14 株，在50%~70%之间的克罗诺杆菌有16 株，其中参考菌株C. sakazakii ATCC 29544T的致死率为60.24%，唯一的1株C. dublinensis分离株的失活率为67.75%，均处于中等耐干燥水平。另外，有6 株克罗诺杆菌的干燥失活率超过70%。相比之下，上述在干燥条件下致死率较低的5 株克罗诺杆菌的耐干燥性更强。
耐渗透压试验结果表明，受试分离株均可在浓度为4%和6% NaCl的TSB液体培养基中生长，并且随着盐浓度的增加，菌株到达对数期和稳定期的时间延长。因此，克罗诺杆菌可耐受的最高渗透压条件为6% NaCl，所有菌株在此条件下的生长曲线如图2b和2c所示。相比于参考菌株，部分C. sakazakii分离株生长速度较快，且达到稳定期的菌体浓度较高，其中生长速度最快的菌株为CS8、CS14和CS7，生长速度次之但稳定期菌体浓度较高的菌株为CS10和CS81，生长最慢的菌株为CS11。多数菌株在10~15 h达到对数期末期，仍有少数生长较慢的菌株在24 h仍未达到稳定期（如CS2和CS11）。非C. sakazakii生长情况均不如标准菌株。因此，耐渗透压能力较好的菌株为CS7（ST17）、CS8（ST21）、CS10（ST23）、CS14（ST42）和CS81（ST260），均为C. sakazakii。
图2 (a) 克罗诺杆菌分离株在干燥条件下的存活率；(b) C. sakazakii在含6% NaCl的TSB培养基中的生长曲线；(c) 非C. sakazakii在含6% NaCl的TSB培养基中的生长曲线
生物膜形成能力结果如图3a所示，菌株CS17的生物膜形成能力最强，OD590 nm值为0.70；CS5的生物膜形成能力最弱，OD值仅为0.18。其中，有4 株菌株（CS20、CS10、CS21和CS14）的OD值处于0.5~0.7之间，生物膜形成能力仅次于CS17。有3 株菌株（CM24、CS32和CT23）的OD值处于0.3~0.5之间。多数菌株（25/36）的OD值分布在0.2~0.3之间，其中参考菌株的OD值为0.25，处于中等水平。有3 株菌株的OD值小于0.20，表明其生物膜形成能力较弱。研究表明，克罗诺杆菌的生物膜形成能力与菌株的耐干燥性有关，因此，将菌株的耐干燥性和生物膜形成能力分别由强到弱排列，得到两者相关性如图3b，多数耐干燥能力较强的菌株生物膜形成能力也较强，部分耐干燥能力较弱的菌株对应的生物膜形成能力也偏低。说明生物膜对细菌的包被结构对处在干燥胁迫环境下的细胞具有保护作用。
图3 (a) 克罗诺杆菌的生物膜形成能力；(b) 克罗诺杆菌耐干燥性与生物膜形成能力的相关性
根据耐干燥和耐渗透试验结果，筛选CS21和CS8作为代表性菌株，分别在干燥和高渗条件下进行转录组测序。对筛选出的差异表达基因进行KEGG富集分析，选择富集最显著的前20 条通路进行气泡图显示。在干燥条件下（图4a），信号通路可分为五大类，其中代谢类别数量最多，包含13 条信号通路和150 个差异表达基因，主要集中在碳水化合物代谢、脂质代谢、异种生物降解和代谢、能量代谢和氨基酸代谢过程。在高渗条件下（图4b），信号通路分为六大类，代谢类别也最多，包含9 条信号通路和62 个差异表达基因，主要集中在氨基酸代谢、萜类和多酮类代谢、次生代谢物的生物合成、辅因子和维生素代谢、碳水化合物的合成和代谢、核苷酸代谢过程。根据干燥处理下RNA-seq分析结果，共筛选到56 个与耐干燥相关的基因，其中31 个基因差异表达。根据渗透压力处理下RNA-seq分析结果，共筛选到66 个与耐渗透相关的基因，其中43 个基因差异表达。
对差异表达基因及其调控通路分析可知，在干燥和高渗条件下，克罗诺杆菌能够活跃生物膜的合成作用，产生更多的海藻糖稳定胞内结构，积累甜菜碱保持细胞水分，同时积累钾离子、镁离子等电解质，从而增加细胞内渗透压以抵抗干燥和高渗的胁迫作用。
图4 KEGG通路富集分析 (a)干燥条件；(b)高渗条件
Conclusion
利用MALDI-TOF MS对35 株克罗诺杆菌进行了准确的鉴定和聚类分析。耐受试验结果表明，分离株对于37 ℃、6 天的干燥条件的失活率在9.01%~77.57%，可耐受最高渗透压条件为6% NaCl，且生物膜形成能力与耐干燥能力呈正相关。通过转录组测序筛选出31 个与耐干燥相关的差异表达基因和43 个与耐渗透压相关的差异表达基因。克罗诺杆菌在2 种处理条件下可以激活生物膜合成，产生更多海藻糖，积累甜菜碱和电解质，稳定胞内结构。同时，首次发现cysM、thuF和ycjO等耐受相关基因。
01
第一作者简介
付世骞，女，宁波大学食品科学与工程学院讲师，主要从事食品中有害微生物的检测、溯源与控制。近五年，以第一作者或通讯作者发表学术论文9 篇（其中中科院一区Top期刊论文5 篇），参与申请发明专利8 项。主持象山县科技计划项目、东北农业大学乳品科学教育部重点实验室开放基金和宁波大学教研项目各1项，参与国家级、省级和横向课题10余项，获全国高校食品科学与工程专业实验教学案例三等奖。
02
通信作者简介
杨鑫焱，女，东北农业大学食品学院副教授，硕士研究生导师，主要从事乳品科学技术与质量安全研究。近五年，以第一作者或通讯作者发表学术论文17篇，11篇为中科院一区Top期刊论文，3篇IF>10；授权发明专利5项；主持十四五国家重点研发计划项目子课题，中国博士后面上资助，国家乳业技术创新中心关键技术攻关，黑龙江省重点研发计划等国家级和省级项目6项。
姜毓君，男，东北农业大学食品学院二级教授、博士生导师，东北农业大学副校长、乳品科学教育部重点实验室主任。入选长江学者特聘教授、国家“万人计划”领军人才。荣获全国食品安全工作先进个人、中国食品科技学会科技创新奖——突出贡献奖。担任国务院食品安全委员会专家委员会委员、中国营养保健食品协会副会长。主要从事乳制品、婴幼儿配方食品和特医食品等特殊食品和功能食品研究，先后承担国家和省部级课题20余项。获得省科技进步二等奖2项，中国和美国专利22件，主编或共同出版专著教材8部。以第一作者或通讯作者发表学术论文200余篇，其中多篇论文被选为封面文章。牵头和参与多项国家食品质量安全法规、标准和技术规范的制定。
Desiccation and osmotic resistance mechanism of Cronobacter spp. isolated from powdered infant formula
Shiqian Fua, Danliangmin Songb, Xue Qinb, Lihan Wangb, Qianyu Zhaob, Chaoxin Manb, Xinyan Yangb,*, Yujun Jiangb,*
a Key Laboratory of Animal Protein Food Deep Processing Technology of Zhejiang Province, Zhejiang-Malaysia Joint Research Laboratory for Agricultural Product Processing and Nutrition, College of Food Science and Engineering, Ningbo University, Ningbo 315800, China
b Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Department of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
*Corresponding authors.
Abstract
Cronobacter spp. has strong resistance to desiccation and high permeability in Enterobacteriaceae, and powdered infant formula (PIF) is one of the main contamination routes. In recent years, the contamination of Cronobacter spp. in PIF incidents occurs from time to time, causing infant serious diseases or death. In this investigation, matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry was used to identify the phenotypes of 35 Cronobacter strains isolated from PIF and its processing environment. Subsequently, the isolates were evaluated for drying and osmotic pressure tolerance. The results showed that the deactivation rate of the strains ranged from 9.01% to 77.57%, and the highest osmotic pressure condition the strains could tolerate was 6 g/100 mL NaCl. In addition, there was a positive correlation between biofilm formation ability and desiccation resistance. Combined with transcriptomics, Cronobacter spp. could activate biofilm synthesis, produce more trehalose, accumulate betaine and electrolytes to stabilize intracellular structure under the two treatment conditions. A total of 31 and 43 genes were found related to desiccation and permeability resistance, respectively. And some genes (cysM, thuF, ycjO, etc.) were found to be associated with two tolerances for the first time.
Reference:
FU S Q, SONG D L M, QIN X, et al. Desiccation and osmotic resistance mechanism of Cronobacter spp. isolated from powdered infant formula[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(3): 9250063. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250063.
本文编译内容由作者提供
编辑：王佳红；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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