《利用农杆菌瞬时表达CRISPR编辑基因和快速筛选突变植株的新方法》作者分享会文字整理版|163

美国康涅狄格大学和南京农业大学李义教授团队近期在Horticulture Research发表了题为“A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants”的研究论文，首次系统报道利用农杆菌在植物细胞中瞬时表达Cas9和sgRNA序列而产生非转基因突变体并高效快速筛选的新方法。该技术为童期长的多年生植物和有性生殖后会产生性状分离的杂合一年生植物提供了一个快速获得不含有外源基因的基因编辑突变体的新方法。

该文章中文介绍：利用农杆菌瞬时表达CRISPR编辑基因和快速筛选突变植株的新方法。

据不完全统计，该论文已被翻译成法文，瑞典文，中文等多种语言，13多家国际媒体对其进行了深度报道。

5月30日晚，《园艺研究》期刊特邀请李义教授团队的三位主要作者在《园艺研究》作者微信交流群（进群方式见文末）中举行了作者分享会：

陈龙正老师，江苏农科院蔬菜所研究员

李威老师，中国农业大学园艺学院引进人才、副教授

丁静老师，南京农业大学园艺学院副教授

三位老师就围绕该新技术的30多个提问进行了认真的解答，分享会历时2.5小时，共有850多位国内外老师同学参加。本文为其文字整理版。

Q1：如何瞬时表达?

Chen：当T-DNA进入细胞核后必须先合成双链DNA，才能整合到基因组上，这些双链DNA只要有启动子和终止子，是一个完整的基因，即便没有整合到基因组中，也能表达，就是瞬时表达。这是一个自然过程，我们是第一次系统的证明了可以用瞬时表达获得突变体。

Q2：介绍一下sgRNA？

Chen：请点击以下链接,进行了解。

https://wenku.baidu.com/view/57074468c8d376eeaeaa31c2.html

Q3：文中最后是怎么确定这个植株内部是不存在T-DNA的，不是都用农杆菌介导的吗？

Chen：可以根据T-DNA设计特异引物，进行验证突变体带不带T-DNA，但在用PCR验证时，T0代会有残留农杆菌的污染，导致假阳性转基因植株，因此在验证时要把植物基因组中的Ti质粒DNA清掉，才能准确验证。点击以下链接，有详细的说明过程。

利用农杆菌瞬时表达CRISPR编辑基因和快速筛选突变植株的新方法

Q4：这种方法对雌雄异株植物有作用吗？

Ding：这种方法同样适用于雌雄异株植物。不过需注意一点，由于使用农杆菌瞬时表达，CRISPR基因并未整合到目标植物基因组上，即Cas9对sgRNA靶定序列的剪切只发生在外植体细胞中，而获得的再生植株中不含有CRISPR基因，不能继续突变目标基因。因此，若雌株、雄株在sgRNA靶定序列上存在差异，或目标基因仅存在于雌株或雄株中，则必须分别使用具有目标基因的雌株或雄株植物的外植体进行农杆菌侵染，以获得突变体。

Q5：农杆菌介导获得的转化苗，可以提取DNA，通过PCR验证sgRNA载体片段，进行阳性验证吗？

Chen：如果是稳定表达得到的转化苗，可以通过PCR扩增sgRNA载体片段验证是不是转基因阳性苗，但不能验证有没有发生突变。如果瞬时表达得到的突变苗不能用PCR扩增sgRNA载体片段验证是否是转基因阳性苗，因为突变苗中没有T-DNA。但可以用PCR的方法去扩增基因组sgRNA区段，确定是否发生突变。

Q6：阳性再生植株里面，是否有嵌合体的存在？

Ding：阳性突变体植株中是可能存在嵌合体的。具体回答可参考上述关于纯合体转化苗的问题。不过我们在获得的烟草PDS基因突变体中，并没有观察到有白色和绿色相间的嵌合体，估计可能与所设计的sgRNA的效率比较高有关。但在最新的柑橘实验中，我们有观察到不少嵌合体的存在。

Q7：用农杆菌介导转化这种方法，在多年生植物中应用，能不能直接得到纯合体转化苗？如果可以，得到的概率多大呢？

Ding：直接得到纯合体转化苗的可能比较小。导致无法获得纯合体转化苗的因素有两个：

1) CRISPR系统突变大多数情况下得到的是杂合体，即突变体植株中目标等位基因虽然都发生了突变，但突变的类型不同。这是由于CRISPR系统形成的突变是由DNA修复系统在Cas9蛋白对目标序列进行剪切之后随机产生的，因此，同一细胞中的等位目标基因上形成的突变类型很可能不同，从而形成杂合突变体植株。

2) 突变体植株还有可能是嵌合体，即植株不同细胞中的突变类型不同。由于我们的培养再生过程不加筛选压，因此获得的突变体再生苗是从单细胞来的可能性要比加筛选压的情况小，即获得的突变体植株是嵌合体的可能性要大于使用筛选压的情况，因此直接得到纯合体转化苗的可能比较小。在有筛选压的条件下得到的纯合突变体的比例应该会比我们不加筛选压的条件高不少。

Q8：在最新的柑橘实验中请问是跟之前的做法一样吗？有没有在载体或者其他地方有所改造，有所变化？

Li：方法基本一样，但载体上需要改造，35S启动Cas9的载体在柑橘上效果不好。

Q9：请问这个瞬时表达体系适用于柑橘吗？

Ding：应该是适用的，李义老师在美国的实验室正在进行这方面的实验。

Q10：想要去除测序造成的误差，不太懂测序和DNA浓度是否有很大关系，是不是测序时所用的DNA浓度一致，才有可比性？

Ding：测序本身与DNA浓度的关系不大，不同样品的测序结果的比较并不需要测序样品保持相同的DNA浓度。实际上，我们进行测序的待测群体母样品、野生型样品和稀释子样品的DNA浓度并不相同。但是我们的方法中引入了一个稀释子样品，为了确保野生型样品对母样品的稀释能够达到5倍以上，以确保真实突变的频率在母样品和子样品之间具有显著的差异，需要首先检测母样品和野生型样品的DNA浓度。

Q11：如何在前期阶段确定CRISPR系统对靶基因的突变效率？

Ding：目前有一些网站，可以根据所设计的sgRNA靶定序列估算CRISPR系统对靶基因的突变效率。不过我们没有进行过这方面的预测，所以缺乏这方面的经验，并不清楚这种预测的准确性有多少，也不清除目标植物的种类、Cas9和sgRNA启动子的选择、农杆菌侵染的方式等因素对这种预测的准确性是否有所影响。

Q12：利用基因编辑获得的突变体，在果树上可以实现吗？

Li：能否成功应用我们所研发的CRISPR瞬时表达体系主要考虑以下两方面因素：

1）农杆菌能否侵染所研究的植物，该植物能否再生，即：组织与细胞能否经过脱分化和再分化再生出新的植物体。

2） CRISPR/Cas9基因编辑系统本身在不同作物上的应用可能存在差异，比如Cas9基因启动子的活性，35S启动子启动Cas9蛋白基因在柑橘上的效果就不好。此外可能有些植物存在密码子偏好性，导致Cas9蛋白在一些植物上表达量较低。

Q13：我想做葡萄高温逆境的实验，有目的基因可以做到葡萄的突变体么？

Li：葡萄中存在成熟的再生体系，并且农杆菌也能够成功侵染葡萄，也应该有瞬时表达活性，CRISPR系统也已有报道可以在葡萄中应用，因此我们的体系是可以应用在葡萄上的。

Q14：这个瞬时表达系统可以用在石榴上吗？

Ding：农杆菌的瞬时表达是普遍现象，在石榴中应该也是可以的，不过还要考虑农杆菌侵染的效率、植物再生效率、CRISPR/Cas9基因编辑系统在石榴中应用的效率等因素。

Q15：这项技术能运用在真菌中吗？

Li：很多真菌都可以通过农杆菌转化，在真菌中也应该存在农杆菌的瞬时表达，此项技术是可以在真菌中应用的，比如蘑菇。

Q16：HRM基因分型技术如何提高熔解曲线分辨率？

Li：

1)减小PCR扩增片段的长度，能够使待测群体和野生型群体突变位点之间的差异更加突出的显示出来，有利于提高熔解曲线的分辨率。建议PCR片段长度在80-200bp之间，越短越好。

2)可以通过调整反应体系各组分浓度来提高熔解曲线分析分辨率，我们发现改变Mg2+浓度能够显著改变熔解曲线分析的分辨率。

3)HRM分析还需购买专门的软件来分析熔解曲线中的细微差异。

Q17：在文章图1中，GUS和Cas9中分别有一个内含子，请问这两个内含子分别是如何选择的？比如Cas9的IV2内含子是来自什么物种？如何保证在植物体中能正确的被剪切掉？

Li：带有内含子的GUS是直接从PCAMBIA1305载体上扩增下来的，Cas9中的内含子是选择土豆ST-LS1 基因的第二内含子。IV2具有植物intron的典型特征：AT含量80%，以及典型的内含子切割边界。并且IV2内部还有几个终止密码子，这样就能确保在大肠杆菌内部不能合成Cas9蛋白，对大部分植物来说，内含子都能被正确切割。

Q18：请问您文章里所构建的两个载体，分别在GUS和cas9中插入了一段intron，起什么作用？

Li：在GUS中插入intron序列，可以抑制GUS蛋白在农杆菌中表达，能够更加准确的判断在植物细胞中的瞬时表达最佳的时间点。在Cas9中插入intron序列，能够抑制Cas9蛋白在细菌中表达，避免非专一的突变细菌基因组上的基因。当然，非专一突变可能性很小。

Q19：文章中表2的6个mutants中均无WT的allele，但实际在CRISPR Knockout 的T0代转基因株系中，WT的allele是比较常见的。文章中也提到这些突变体都是随机选择的。那在选择的mutant中，cas9 free 的且没有WT的allele的mutant能占到总mutants的多少？表2中的那些是cas9 free的还是带cas9的？

Li：在本实验中，我们是以表型（白化苗）鉴定突变体，我们所用的烟草为四倍体，每个基因有四个alleles, 只有四个allele均突变才会产生白化苗，因此突变体中不存在WT的allele，如果有野生型的allele，会呈现绿色的，但是实验过程中看到的嵌合体很少，有可能是我们所用的sgRNA效率很高。但是在柑橘中我们发现同样突变pds基因，嵌合体的频率很高，存在野生型的allele。

以全部再生的植株为基数，白化pds突变体的频率为2.6%（包括：携带T-DNA和不携带T-DNA）。其中，不携带T-DNA的白化苗突变体占总白化苗突变体的频率为17.2%。表2中的突变体有的是cas9 free的，有的含有cas9，在确定突变类型时，随机选择了10株，没有考虑是否有Cas9蛋白。

Q20：看起来需要很多再生苗，再生用了多久时间? 很多文章都是用愈伤侵染再生的，那用叶片侵染再生有什么优势？会更容易吗？

Ding：烟草再生大致需要2-3个月，不同的植物再生所需要的时间不同。不同植物常用于侵染再生的外植体不同，所用外植体不同可能会影响到侵染和再生等过程的效率，通常选取文献报道中目标植物农杆菌侵染和植株再生效率比较高的外植体进行实验。

Q21：通过瞬时表达获得不含转基因的突变体概率有多大？

Chen：如果以外植体计算频率，非转基因的白化突变苗为8.2％；以再生总芽数计算，非转基因的白化苗频率为0.44％；如果以总白化苗突变体为基数计算，非转基因的白化苗频率为17.2％。

Q22：按照上述问题所讲，再生芽中白化率为0.44%，非转基因率为17.2%，即白化非转基因率为0.075%，这是在烟草中，那么在非模式植物中，尤其木本植物中，岂不是概率还要更低？

Ding：0.44%是非转基因白化苗的频率。白化苗生长在没有筛选压的情况下是弱势的，因此其他基因的突变体频率有可能会比这个频率高好几倍，但也有可能更低。瞬时表达产生非转基因突变体的效率的高低与是否是模式植物或木本植物没有关系。

Q23：文章里提到一个外植体可以再生出多个再生植株，想问一下在分离再生植株的时候，会注意同一个愈伤组织只取一个再生植株吗？因为据我所知，同一个愈伤组织分化的植株的基因型是一样的。

Li：我们会注意同一个愈伤组织只取一个再生植株，选择的再生植株来自于不同的愈伤。

Q24：这套体系有没有已在或正在其他植物中进行验证，是否可行？

Ding：农杆菌的瞬时表达是普遍现象，应该在多数植物中都可以适用。

Q25：CAS9序列很长，是不是会影响T-DNA表达效率？