不同处理方式的大曲真菌群落差异分析

作为白酒酿造的糖化发酵剂，大曲与白酒风味物质的产生、风格的形成及质量的变化密切相关。由于其开放式的制作方式，大曲中的微生物类群十分丰富，包括霉菌、细菌及酵母菌等，这些微生物能够产生各种酶和风味物质，因此，微生物群落是决定大曲品质的核心因素之一。大曲中数量巨大的微生物类群的准确描述和定义、功能菌的精准定位、微生物与白酒酿造调控技术等研究一直是白酒酿造领域的重大理论和技术问题。

为探究外源热风干燥对大曲在贮存期带来的相关影响，四川理工学院生物工程学院的夏 玙、罗惠波*和劲牌有限公司的周 平等人采用实时荧光定量PCR和高通量测序技术，对排潮降温期大曲进行热风、自然干燥处理后，对比实验室贮存、曲库贮存以及自然干燥后曲库贮存不同处理方式下大曲的真菌微生物群落差异，以期为进一步优化大曲干燥工艺提供技术依据，为指导大曲热风干燥工业化应用提供一定的参考。

1 实时荧光定量PCR结果分析

以4.287×108 copies/μL为起始浓度，设置5 组10 倍稀释浓度的标品，制作标准曲线。标准曲线方程为：Y＝－3.144 3X＋45.654，R2＝0.997 3，扩增效率为107.992%，表明不同稀释梯度定量模板的对数值和Ct值之间呈现良好的线性关系。本实验所建立的标准曲线能够准确地反映目的产物的扩增，且由样品的Ct值就可算出样品中的真菌数量。

2 不同处理的大曲真菌Alpha多样性

97%水平下共得到OTU数为844，每个大曲样品的OTU数都在80以上。分析被注释到不同分类水平的真菌类群发现，大曲RG3的Chao1丰富度指数较高，Shannon和Simpson多样性指数分析表明大曲RG2、RG3、ZR3的微生物多样性较高。从工艺处理角度通过动态比较分析大曲的多样性指数发现，相比RG1，不论是通过热风干燥工艺还是自然干燥工艺对大曲进行处理后，大曲FK1与ZR1中真菌的丰富度指数均有所下降。通过比较ZR1、ZR2、ZR3的OTU、Chao1丰富度指数，发现呈先下降后上升的趋势；而进行热风干燥后的大曲，相比FK1，进行曲库贮存后的大曲FK2、FK3的多样性指数均有呈先下降后上升的趋势；进行实验室贮存后的大曲RG2、RG3的多样性指数均有上升的趋势，且比其他处理大曲的多样性高。

3 不同处理大曲的群落组成结构

结果显示：所有大曲样品里，真菌微生物属水平上有4 种相对高丰度的微生物，平均相对丰度最高的是嗜热子囊菌属（Thermoascus），其次是根毛霉属（Rhizomucor）、曲霉菌属（Aspergillus），相对较低的是假丝酵母属（Candida）。

在属的分级水平上，共检测到19 种真菌类群，优势类群包括有：嗜热子囊菌属、嗜热霉菌属（Thermomyces）、根毛霉属、曲霉菌属、假丝酵母属，其相对丰度占全部真菌群落的92.3%以上，其中最优势菌属是嗜热子囊菌属，约占40.2%。

4 大曲真菌在属水平上的微生物组成热图

所有样品大致分为4 组。大曲RG3根据丰度信息单独聚类为一大组；其他8 种大曲聚类为一大组，表明了8 种大曲之间类似的群落结构，其中，ZR2的真菌群落独立为一组，大曲RG2和ZR3近似，FK1、FK3、RG1、ZR1、FK2聚类成一组。

5 PCA结果

运用PCA方法比较不同处理方式的大曲，可获得两个主成分，主成分1的贡献率为77.16%，主成分2的贡献率为12.04%，累计贡献率达到89.2%，因此主成分1和主成分2基本可以全面反映研究区域真菌微生物群落情况并将不同处理方式的大曲真菌群落区分开来。大曲样品RG1和ZR1聚集，FK1虽落点较远，但根据主成分1（贡献率达到77.16%）可以将FK1与RG1、FK1聚成一类，说明热风干燥工艺对大曲的真菌微生物群落有一定影响但影响较小；FK3、ZR3聚集，说明基于热风干燥工艺并返回曲库贮存这一处理方式的大曲与自然干燥自然贮存的大曲差异不明显；而RG3落点相对较远，说明热风干燥后经实验室贮存2 个月的大曲真菌群落有较大的变化。

结 论

结果发现不同处理方式大曲中的真菌18S rRNA基因拷贝数在1×1011～4.5×1011 copies/g之间；ZR3拷贝数最大为4.5×1011copies/g。基于大曲的真菌多样性指数分析，大曲RG2、RG3、ZR3的多样性较高。属水平上相对丰度的解析中，不同处理大曲的优势真菌类群均为嗜热子囊菌属、根毛霉属、曲霉菌属、假丝酵母属。其中嗜热子囊菌属在大曲真菌群落中具有明显的优势，若要保持其优势，需提供曲库的贮存条件；而实验室贮存环境相比于曲库更有利于曲霉菌属类的生长；干燥工艺后的环境更利于假丝酵母属类生长。

PCA可看出基于热风干燥工艺并返回曲库贮存这一处理方式的大曲与自然干燥自然贮存的大曲差异不明显；而大曲RG3落点相对较远，再结合微生物组成热图可分析大曲RG3中耐盐真菌、丝衣霉菌属、青霉菌属、曲霉属在大曲RG3中的比例远大于其他大曲，是大曲RG3区别于其他大曲的主要真菌群类，说明热风干燥工艺以及热风干燥后经过2 个月实验室贮存的大曲中真菌群落有较大的变化，差异性明显，故此类大曲有进一步研究的价值，为后续研究提供参考。

本文《不同处理方式的大曲真菌群落差异分析》来自于《食品科学》2018年39卷22期166-172页，作者：夏玙，罗惠波，周平，黄丹，邓波，沈才萍，邬捷峰。DOI:10.7506/spkx1002-6630-201822026。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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