视频文字整合人：赵霜
声明：本文摘录于原国家食品药品监督管理总局（现国家市场监督管理总局）科技和标准司发布的《食品安全国家标准实操视频》，版权归其所有。本次文字整合仅限交流学习使用，不做任何商业用途。
一 基本概念
志贺氏菌视频
1 什么是志贺氏菌
志贺氏菌（Shigella）：属于肠杆菌科志贺菌属，革兰氏阴性杆菌，无芽孢，无荚膜，无鞭毛，多数有菌毛。兼性厌氧，能在普通培养基上生长，形成中等大小，半透明的光滑菌落。
志贺氏菌鉴定是基于生化反应的，分型方法是血清分型。
2 志贺氏菌属的组成
志贺氏菌属由四个种组成，分别是痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌。它们是引起人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。
3 志贺氏菌的传染源
细菌性密集是最常见的肠道传染病，夏秋两季患者最多，传染源主要为病人和带菌者，通过污染了志贺氏菌的食物、饮水等经口感染，人是志贺氏菌的唯一宿主，人对志贺氏菌普遍易感，食道200的细菌可使10%-50%的志愿者感病，所以在检测食品时，常把志贺氏菌作为卫生指标。
二 食品中志贺氏菌的检验
食品中志贺氏菌的检验：GB 4789.5-2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》
1 适用范围
本标准规定了食品中志贺氏菌的检验方法，适用于食品中志贺氏菌的检验。
2 基本要求
a）检验环境要求：
志贺氏菌应在二级生物安全实验室（Biosafety Level 2 Laboratory）内进行，样品检验应在食品洁净区内进行（Clean Work Area），食品检测区与阳性区应在不同区域内进行，严格分开。进出洁净区应严格登记。
b）检验人员要求：
检验人员应具备生物安全上岗证，压力容器上岗证，微生物检验人员上岗证，进入洁净工作区前，检验人员需要二次更衣，佩戴帽子、口罩、一次性无菌手套，换鞋。
c）检验设备要求：
使用仪器需要定期进行检定/校准，每次使用仪器前需填写仪器使用记录，开生物安全柜，紫外线照射30分钟，酒精消毒台面，待风机运行5分钟以上再进行实验。
d）检验用培养基：
检验用培养基均应符合GB 4789.28-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》，按国家标准要求志贺氏菌选择分离平板应使用两种/两种以上平板，其中一种为XLD平板，另一种为志贺氏菌显色平板/麦康凯琼脂平板。
XLD、麦康凯琼脂为中等强度选择性培养基，XLD用于沙门氏菌和志贺氏菌的分离，麦康凯琼脂用于分离发酵乳糖的革兰氏阴性肠道杆菌。
志贺氏菌分离培养基的制备：称取培养基置于无菌瓶中，加适量蒸馏水煮沸溶解，煮沸时间不宜过长，沸腾即可，50℃水浴平衡30min后，倾入平皿。移入前，平皿可置于生物安全柜内干燥，去除表面水分。
e）生物垃圾的处理：
所有生物垃圾应经121℃高压灭菌30min后，方可运离实验室。
3 食品中志贺氏菌的检验
包括样品前处理、选择性增菌、选择性平板分离、染色、生化鉴定，血清学分型及报告，样品与阴性对照应在食品检测洁净区进行。
样品处理与增菌：酒精棉球擦拭样品包装外表面，用无菌剪刀剪开包装后，称取样品25g±0.1g至225ml志贺氏菌增菌肉汤，均质器拍打1-2min，取225ml志贺氏菌增菌肉汤作为阴性对照，阳性对照应在二级安全实验室内制备。
取一粒质控菌球作为阳性对照，然后将标准菌株制备成每毫升10-100ml菌悬液作为阳性对照，样品阳性对照/阴性对照与41.5±1℃厌氧培养16~20h，如无厌氧培养箱则采用厌氧罐，并且以厌氧指示剂指示厌氧环境中厌氧状态，从样品指示箱取出样品阴性对照，样品阴性对照的平板划线应在生物安全实验室进行。
XLD琼脂平板、志贺氏菌显色培养基平板、麦康凯琼脂平板于36±1℃，培养20-48h。
典型志贺氏菌在XLD琼脂平板上，菌落呈粉红色至无色，半透明，光滑，湿润，圆形，边缘整齐或不齐。
志贺氏菌在麦康凯琼脂平板上呈无色至浅粉红色，半透明，光滑，湿润，圆形，边缘整齐或不齐。
志贺氏菌在志贺氏菌显色培养基的菌落特征按照说明书进行判定。
选择平板上可疑菌落挑选原则，从每个平板挑取至少2个典型菌落或疑似菌落。
4 志贺氏菌的鉴定
革兰氏染色及镜检：
a）手工染色：用10μL接种环挑取无菌生理盐水闭环在载玻片中央，挑取单个可疑菌落涂布成均匀的一薄层，手持载玻片一端，标本向上，进行酒精加热固定，温度不宜过烫，放置待冷后进行染色，结晶紫初染1分钟，碘液1分钟，酒精脱色30秒，复染色1分钟，每布染色后，需斜置载玻片，用小水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止，注意冲洗时不要直接冲洗涂层表面，待标本干后置于显微镜下观察。
b）自动化染色：开机，清洗，取盘，装片。
5 志贺氏菌检验流程图
校核人：周红艳
2020年4月10日
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