自组装多肽水凝胶对百里香精油的控释作用、抑菌和抗氧化效果的延长作用

百里香精油是百里香经过水蒸气蒸馏所得的油状产品，主要含有醇、酯、酚、单萜等挥发性成分。百里香精油在防腐、提高免疫力、抗癌、抗病毒、止痛、抗氧化、延缓衰老等方面具有极高的药用价值。但其自身稳定性较差，极易挥发，且提取的高浓度百里香精油带有一定的刺激性气味，使得百里香精油在食品中的应用受到极大限制。对百里香精油进行包埋并控制其释放，是目前解决该问题的主要途径。

目前主要的包埋材料有环糊精或食品胶。近年来也有新的包埋材料出现，虽然这些方法都具有较高的包埋率（85%以上），有一定的抑制百里香精油挥发或者缓慢释放精油的效果，但是大多制备工艺复杂且不能有效控制百里香精油在不同环境中的释放。多肽水凝胶是以多肽分子为凝胶因子来束缚水分子，从而形成的半固体透明状凝胶。相比于其他传统的包埋材料，具有生物相容性好、易于合成及pH值响应等优点。目前多肽水凝胶多用于药物的控制释放。但是目前利用多肽水凝胶实现对精油类物质进行控释的研究还鲜有报道。

本课题组前期利用N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸（Fmoc-F）水凝胶包埋大蒜精油和丁香精油，包埋率都可达90%以上，并且Fmoc-F水凝胶对包埋的精油具有控制释放的作用，但其成胶机制与结构还鲜有研究。因此，特医食品加工湖南省重点实验室、稻谷及副产物深加工国家工程实验室以及中南林业科技大学食品科学与工程学院的赵梦倩、张雅丹、张琳*和张继红*等人利用Fmoc-F为水凝胶因子，将具有抑菌效果的百里香精油作为包埋物，利用流变仪、圆二色谱、近红外光谱等技术研究其成胶机制及凝胶特性，通过多肽水凝胶的分解实验、抑菌实验、抗氧化实验研究多肽水凝胶的pH值响应性及其对丁香精油的包埋控释作用、抑菌和抗氧化效果的延长作用，为精油类物质提供新型、廉价、生物相容性好的有效控释包埋材料。

1 Fmoc-F水凝胶及Fmoc-F/百里香精油水凝胶的流变学特征

如图1所示，Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油样品的G’和G’’都随时间延长而上升。在160 s之前，Fmoc-F样品的G’小于G’’，说明样品呈现流体性质；160 s后，G’大于G’’，样品呈现一定的刚性，即成胶（图1A）。利用Fmoc-F包埋百里香精油的样品的凝胶点在50 s（图1B）。证明Fmoc-F包埋百里香可以形成凝胶，且百里香精油可以缩短Fmoc-F的成胶时间。

如图2A所示，Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油样品的G’在4 000 s之前都随时间延长而上升，4 000 s后基本保持不变。在样品成胶以后，Fmoc-F/百里香精油胶体的G’始终大于Fmoc-F胶体，证明Fmoc-F/百里香精油胶体的强度更优于Fmoc-F胶体。在频率10 Hz以内，Fmoc-F胶体的G’随着频率的变化有缓慢上升，而Fmoc-F/百里香精油的G’在该频率范围内基本不变（图2B）。说明Fmoc-F胶体是一种较为松弛的凝胶，而百里香精油的加入填补了Fmoc-F分子间的空隙，使凝胶的结构更为紧密，胶体的强度也更强（图2A）。

2 Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油的二级结构分析

为研究Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油的二级结构，利用圆二色谱进行检测。结果如图3所示，Fmoc-F在217 nm波长处有一个明显的负峰，证明Fmoc-F很可能是呈β-折叠结构，同样，在Fmoc-F/百里香精油的样品中在同一位置有明显的负峰，此外并没有明显的其他峰的出现。因此Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油水凝胶主要的二级结构极可能都是β-折叠结构，并且百里香精油的加入，并不影响Fmoc-F的二级结构。

3 傅里叶变换红外光谱研究胶体的分子间作用

采用傅里叶变换红外光谱分析水凝胶的特殊基团，结果见图4。Fmoc-F水凝胶在3 448 cm－1处出现酰胺A带的N—H或O—H伸缩振动吸收峰；3 334 cm－1是—NH的伸缩振动峰，2 954 cm－1是酰胺B带的N—H或O—H伸缩振动吸收峰，1 697 cm－1是C＝O的伸缩振动峰。与Fmoc-F水凝胶相比，在Fmoc-F/百里香精油的谱线中，3 448 cm－1处的伸缩振动吸收峰变宽，3 334 cm－1处的伸缩振动吸收峰移动至3 342 cm－1处，2 954 cm－1处的伸缩振动吸收峰移动至2 960 cm－1处，1 697 cm－1处的伸缩振动峰增宽且移动至1 674 cm－1处，这些变化证明分子间氢键的存在。因此推断百里香精油是通过疏水作用力推动，与Fmoc-F分子形成分子间氢键从而形成水凝胶。

4 Fmoc-F和Fmoc-F/百里香精油多肽水凝胶的形貌

Fmoc-F水凝胶与包埋百里香精油的Fmoc-F水凝胶，经液氮处理、冷冻干燥后用扫描电子显微镜观察胶体的形貌，结果如图5所示。Fmoc-F水凝胶为纳米纤维结构（图5A），纤维分布不太均匀。Fmoc-F/百里香精油也具有长的、纤维状的三维空间结构（图5B），纤维分布更均匀。正是因为这种更均匀的纤维网络结构，导致Fmoc-F/百里香精油凝胶比Fmoc-F水凝胶具有更高的G’（图2）。

5 Fmoc-F水凝胶在不同pH值下的分解率

Fmoc-F水凝胶具有pH值响应性，为研究其在不同pH值下的分解率，将Fmoc-F水凝胶分别放在不同pH值的磷酸盐缓冲液中，在不同的时间测定溶液中Fmoc-F的特征吸收峰（264 nm波长处的吸光度），从而计算其分解率，结果如图6所示。由图6可知，在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，前20 min内凝胶的分解率仅有3.5%，40～180 min内，其分解率稳定在5.0%左右。在pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，前20 min内凝胶分解率为7.8%，之后也稳定在10.0%左右。在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中，前100 min内Fmoc-F水凝胶的分解率逐渐提高，由12.7%增长到38.6%。但100 min后凝胶的分解率未出现明显的上升。在pH 5.5的磷酸盐缓冲液中，前20～100 min内，Fmoc-F水凝胶的分解率从21.6%提高到50.9%，100 min后分解率上升不明显。在pH 5.0与pH 4.5的磷酸盐缓冲液中，到100 min时分解率分别达到89.5%和93.6%，在140 min时，完全分解。

结果表明，Fmoc-F水凝胶具有明显的pH值响应特性，其在酸性条件下会分解，在中性条件下可以形成稳定凝胶。当pH＜6.5时，溶液呈现酸性，且随着pH值的逐渐降低，溶液中正电荷不断增加，Fmoc-F分子带正电荷而使分子间的斥力逐渐增大，当分子间斥力大于分子间的疏水作用力时，凝胶结构被破坏，Fmoc-F分子发生分解。当利用Fmoc-F包埋百里香精油时，凝胶也会因为环境pH值的变化发生分解，从而释放其中包埋的精油。

6 Fmoc-F水凝胶对百里香精油的包埋和控释作用研究

6.1 Fmoc-F水凝胶对百里香精油的包埋率

计算Fmoc-F对百里香精油的包埋率，实验结果表明Fmoc-F多肽水凝胶对百里香精油的包埋率高达93.13%，具有很好的包埋效果。

6.2 Fmoc-F水凝胶对百里香精油的控释作用和对抑菌效果的延长作用

为了研究Fmoc-F水凝胶对百里香精油的控释作用及Fmoc-F/百里香精油水凝胶的抑菌效果，利用百里香精油、Fmoc-F水凝胶、包埋百里香精油的Fmoc-F水凝胶作液体抑菌实验，结果显示，A组在培养24 h的过程中，菌液OD值呈现出典型的大肠杆菌的生长周期；B组OD值变化与A组一致，证明单独的Fmoc-F水凝胶对大肠杆菌的生长并没有抑制效果；C组因为加入百里香精油，在0～24 h，其OD值明显小于A、B组，证明百里香精油的加入可以较好地抑制大肠杆菌的生长；D组在0～1 h内，菌液pH＞6.5，Fmoc-F水凝胶基本没有分解，被包埋的百里香精油无法发挥抑菌作用，在1～4 h内，菌液pH＞5.5，Fmoc-F水凝胶少量分解，百里香精油开始缓慢释放到菌液中，发挥抑菌作用。

随着培养时间的延长（10 h后），菌液中微生物数量增多，溶液pH值下降到5左右，Fmoc-F水凝胶分解增多，百里香精油释放出来，完全发挥抑菌效果。此外，10 h后，对比C、D组，发现D组的抑菌效果好于C组，这是因为C组中，由于百里香精油加在溶液中，导致培养后期有部分精油挥发；而D组由于百里香精油被包埋在Fmoc-F水凝胶中，大肠杆菌数量增多，导致溶液pH值下降后才释放出来，因此有效抑制了百里香精油的挥发，从而延长百里香精油的抑菌效果。

从上述实验可以看出Fmoc-F水凝胶能抑制培养液中百里香精油的挥发，提高其稳定性，并且由于Fmoc-F水凝胶的pH值响应特性，可以对百里香精油进行有效的控制释放，根据菌液的生长情况缓慢释放被包埋的精油，从而达到长效抑菌效果。

7 Fmoc-F水凝胶对百里香精油抗氧化作用的影响

除了抑菌作用，百里香精油还有抗氧化作用，为研究Fmoc-F水凝胶对百里香精油抗氧化效果的影响，测定了百里香精油、Fmoc-F水凝胶包埋百里香精油的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基及羟自由基清除率。结果显示，对比A、B两组发现，A组样品的自由基清除率略大于B组，这是由于B组百里香精油是包埋在Fmoc-F水凝胶内的，实验过程中有少量精油在胶体内没有完全起到抗氧化作用；对比A、C两组发现，A组样品的自由基清除率远大于C组样品，这是由于C组经20 h放置后，百里香精油大量挥发，使其抗氧化效果减弱，自由基清除率大大降低；对比C、D两组发现，D组样品的自由基清除率大于C组，这是由于Fmoc-F水凝胶的包埋作用，使得百里香精油缓慢释放，减少其挥发作用，延长百里香精油的抗氧化作用。D组羟自由基清除率相比B组略有下降，可能是因为精油并不溶于水，在水相体系中，精油更倾向于附着在Fmoc-F胶体上，因此放置20 h后溶液中精油的有效浓度减少，从而导致对羟自由基清除率的轻微下降。上述结果说明Fmoc-F水凝胶对百里香精油有较好的控释作用，可以减少百里香精油的挥发，延长其抗氧化效果。

结 论

本实验利用Fmoc-F水凝胶包埋百里香精油，通过流变仪、圆二色光谱、傅里叶变换红外光谱、扫描电子显微镜研究其成胶机制及微观结构；通过紫外吸收、抑菌和抗氧化研究Fmoc-F水凝胶的pH值响应性及其对百里香精油的控释作用和长效抑菌、抗氧化作用。通过流变学实验发现，百里香精油可以加速水凝胶的形成，并提高其刚性；圆二色谱表明Fmoc-F水凝胶和Fmoc-F/百里香精油水凝胶的二级结构都可能是β-折叠结构；傅里叶变换红外光谱和扫描电子显微镜结果说明百里香精油与Fmoc-F分子形成水凝胶主要是通过分子间氢键形成均匀纤维状三维网络结构；紫外吸收实验说明Fmoc-F具有pH值响应性；抑菌实验和抗氧化实验说明当溶液pH≥6.5时，Fmoc-F水凝胶可有效包埋百里香精油，并且抑制百里香精油的挥发，其包埋率可达93.13%，当溶液pH＜6.5时，Fmoc-F水凝胶开始分解，释放百里香精油，从而起到缓释精油、发挥其长效抑菌和抗氧化的效果。

本文《自组装多肽水凝胶对百里香精油的控释作用、抑菌和抗氧化效果的延长作用》来源于《食品科学》2020年41卷15期8-14页，作者：赵梦倩，张雅丹，王迎香，刘娜，张楠，简家钰，张琳，张继红。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190725-327。

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