WB 新动态，你知道了吗？

去年，众多杂志社的投稿指南中都要求作者提供 WB 相关的原始数据，并存放在可用的数据库中，提供可查询的信息，比如 PLOS ONE 和 Nature Research。

（截于 PLOS ONE 官网）

（截于 nature research 官网）

近来，杂志社对 WB 结果又有了新要求，要求作者提供未切割的 WB 全膜条带。比如在《cell》作者须知里面也指出需要提供原始的未裁剪的原始数据，如果未按时提交，可能推迟发布或存在撤稿风险。这个要求的出现让众多准备投稿或者已投出的科研汪又开始抓耳挠腮，要计划补实验了。

（截于 cell 官网）

小编也在这里提醒正在实验研究阶段的人员，应着重注意一下自己心仪的杂志社是否有要求 WB 结果需要提供全膜未切割的原始图片，大家提前注意这些问题，避免影响文章接受……

那么，杂志社为什么这样要求呢？

很简单，毕竟目标蛋白和内参蛋白在同一张膜上，就可以避免上面数据造假的情况发生。

知己知彼、百战不殆

对于靶蛋白，你要尽可能的了解它，就像了解晚饭吃了什么一样清楚。

① 蛋白丰度：比如要用人的血浆检测白蛋白，由于白蛋白的丰度是非常高的，如果直接检测，背景就会非常高，因此在对样品进行相应稀释后，得出的条带就会非常单一，相反，蛋白丰度低时，就需要适当增加上样量或者增加抗体浓度。

② 表达条件：有些蛋白需要药物或外界刺激才能检测到条带。

③ 蛋白表达的时效性：某些蛋白被刺激后，在某个时间段是有表达的，其他则不表达，so～ 要确定好时间，不然就要重做了。

④ 分子量的大小与实验难度息息相关，太大太小都不利于做 WB 实验：

  1. 20~70 KD，一般是常规的分子量的蛋白，在实验过程中难度相对较小，由于其与胶里面的 SDS 成分有较大差异，那么在一定电流方向的作用下，就能够顺着电流方向向下电泳，这样更容易出现漂亮的结果；

  2. 10~20 KD 属于小分子蛋白，因为蛋白分子小，包裹上 SDS 后就和胶里面本身的 SDS 差别不大，在电流作用，它不会与常规分子量的蛋白一样乖巧的顺流而下，毕竟旁边胶里面的 SDS 区别不大，可能走着走着就随心所欲了。

    所以最好多压一会，让蛋白尽量聚集；电泳时间短一点，marker 稍微跑开之后，能够分开小分子蛋白和内参即可，尽量避免电泳时间过长，这样蛋白会分散开，一抗就不容易识别到分散的蛋白了。

  3. 最后，还有一些大分子量的蛋白，比如大于 200 KD，他们通常需要较小浓度的分离胶，跑胶的时间要相应的加长，转膜时间也要适当加长，具体还是要根据分子量而定。

⑤ 蛋白是否有转录后的修饰：经常发生的修饰有磷酸化、糖基化，这些都会使蛋白分子与预计大小有些不同。

⑥ 蛋白的定位：对于细胞膜蛋白、细胞核蛋白这些具有特殊定位、不容易提取蛋白的情况要提前做好分析。

实验结果异常分析

你以为这就完了吗，当然不行，小编还精心准备了各种异常结果的分析，文字较长，建议收藏！

①「啥也没有」

分析原因：比较多，如果单纯一张没有显色的 X 光片，可能是一抗或者二抗加错了，故操作过程中要仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题；

②「高背景」，高背景可能是 WB 实验中最常见的问题，目的条带单一清晰，但其他地方又出现连续的、均一的背景；

分析原因：封闭没做好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够，建议洗膜：8 min*5 次或 10 min*4 次；

③「非特异性条带」

分析原因：一抗特异性与蛋白结合，建议更换一抗或者降低一抗浓度，采用阴性对照或阳性对照确定正确的目的条带；

④「条带中出现规则的白圈」

分析原因：电转中膜和胶之间存在气泡，建议仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡；

⑤「出现黑点或黑斑」

分析原因：膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合，建议封闭结束后要洗三遍再加一抗；

⑥「条带拖尾」

分析原因：蛋白量太大，一抗浓度太高或作用时间太长，所以洗一抗和二抗是千万不要偷工减料；

⑦「出现重影」

分析原因：荧光强度较高，或者在压片时，放好后又不小心移动了一段距离；

⑧「条带呈哑铃状」

分析原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一；

⑨「其他」

  • 出现纵向纹理：可能是上样样品中出现不溶颗粒；

  • 在分离胶中跑不动：可能忘记加 SDS；

  • 条带两边向上：可能是凝胶冷却不均一或者电泳槽老化造成；

  • 条带中间向上凸起：可能是凝胶左右两头没有凝固好；

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图文来源：维伯鑫

题图来源：站酷海洛