• 绞股蓝皂苷（SV）处理抑制了人肝癌细胞（HepG2）的生长

  • SV通过调节与细胞周期相关基因的表达水平，在G0/G1阶段阻滞细胞周期

  • SV增强了HepG2内活性氧（ROS）的生成

  • SV通过死亡受体和线粒体途径诱导HepG2细胞凋亡

Introduction

活性氧（ROS）是一种重要的细胞凋亡诱导剂，从而阻断癌细胞的迁移，使细胞周期停滞。由于放疗、化疗、手术等传统疗法预后差、副作用大，研究人员探索了不同的植物化学药物和临床方法治疗肝癌，且疗效显著。细胞周期停滞和肿瘤细胞凋亡是最好的策略，可以借助多种植物化学物质对抗细胞生长异常。

绞股蓝在亚洲，特别是在中国南方山区被人们作为活络剂使用。随着时间的推移，绞股蓝的叶子、茎也被中国人用来治疗普通感冒和传染病、心血管疾病、肝炎、高脂蛋白血症和癌症，已有数百年的历史。绞股蓝皂苷（SV）是一种三萜类化合物，以皂苷的形式存在，从绞股蓝中提取。SV具有许多药理特性，如抗炎、调节脂质代谢、抗氧化、抗增殖、神经保护、抗焦虑等活性。绞股蓝在饼干、面条、洗面奶、沐浴油，以及保健品中发挥着重要作用。我国西南地区的人们经常把绞股蓝作为茶叶饮用，并显示出长寿和无癌生存期的功效。

尽管SV有多种类型，在多种人类癌症细胞系中表现出细胞周期停滞、细胞凋亡的作用，但目前尚无资料解释SV是否能诱导HepG2的细胞周期停滞、细胞凋亡和ROS生成。合肥工业大学的Sayed Sajid Hussain、Zhaojun Wei等在本研究中首次证明SV对体外HepG2的细胞周期停滞、细胞凋亡和ROS生成有影响。

Results

SV对HepG2细胞增殖的抑制作用

将细胞暴露在不同浓度的SV中24 h和48 h后，进行MTT检测，研究SV对HepG2的抑制作用。观察发现，SV对HepG2的抑制作用具有时间和剂量依赖性。在浓度为100 μmol/L时，5-氟脲嘧啶（5-Fu）维持的抑制率为52.53%。随着SV浓度的增加，对HeG2细胞增殖的抑制作用通过剂量和时间依赖性显著增加（图1A）。SV对HepG2的IC50值分别为孵育24 h的139.81 μmol/L和孵育48 h的119.12 μmol/L（图1B）。

A.抑制率；B.抑制曲线。

图1 SV处理对HepG2细胞增殖的抑制反应

SV对HepG2细胞周期阻滞的影响

与未处理的细胞相比，经SV处理的细胞在G0/G1期发生了显著变化。浓度为30、60、90、120 μmol/L和150 μmol/L的SV处理后，G0/G1期细胞比例分别提高到64.4%、65.1%、67.8%、75.6%和83.7%（图2）。研究表明，SV可以诱导HepG2的细胞周期停滞在G0/G1期。

A. SV处理后HepG2的细胞周期分布；B.不同浓度SV处理24 h后，不同细胞周期的细胞数。

图2 SV处理的HepG2中的G0/G1期细胞周期停滞

用SV处理后，HepG2细胞中Cyclin D1、Cyclin E、CDK1、CDK2、Survivin、CHK2和p16的mRNA表达水平被下调，而p21、p27、p53、Wee1和p62的mRNA表达水平被上调（图3A）。此外，通过蛋白质印迹检测，也观察到对负责G0/G1阻滞的相应蛋白表达水平的类似影响（图3B和3C）。

A.～B. mRNA表达水平（β-肌动蛋白表示内部对照）；C.～D.蛋白质表达水平。

图3 细胞周期相关基因和蛋白在SV处理的HepG2细胞中的表达

SV对HepG2细胞凋亡的影响

孵育后用Annexin-V和PI进行流式细胞仪分析，评估凋亡细胞的比例，结果显示，SV处理24 h后，凋亡细胞包括早期凋亡和晚期凋亡阶段的总比例明显增加（图4）。用SV处理24 h后，表明SV能有效诱导HepG2细胞凋亡。

A. Annexin-V-PI双重染色后四个象限中的凋亡细胞分布（a.未处理；b. 90 μmol/L；c. 120 μmol/L；d. 150 μmol/L）；B.早期和晚期凋亡中凋亡细胞的比率。

图4 SV处理诱导HepG2细胞凋亡

SV对HepG2中ROS生成的影响

ROS的产生通过FCM的荧光探针DCFH-DA来分析。结果表明，不同浓度的SV处理后，HepG2中ROS的生成以剂量和时间依赖的方式增强（图5）。HepG2中的ROS水平分别从未处理组的51.3%提高到60、90、120 μmol/L和150 μmol/L SV处理组的69.0%、74.3%、95.8%和99.0%（图5）。

A.未处理；B.不同浓度的SV处理。

图5 SV处理对HepG2中ROS生成的影响

SV对线粒体途径基因表达的影响

线粒体途径被认为是导致细胞凋亡的主要内在途径之一。为研究SV对HepG2细胞的影响，采用RT-PCR和蛋白质印迹方法研究了Bcl2、Bcl xl、Bax、Bak、Cyt c、Smac、Apaf1、Bad、Caspases 3和Caspases 9基因的表达水平。经SV处理后，HepG2细胞中Bad、Bcl2和Bcl xl的mRNA表达水平被下调；而Bax、Bak、Smac、Cyt c、Caspase3和Caspase9的mRNA表达水平被上调（图6A）。HepG2细胞中Bcl2和Bcl xl蛋白水平下降，Bak、Bax、Smac、Caspase 3和Caspase 9蛋白水平上升（图6B，6C），清楚地表明线粒体途径参与了SV诱导的细胞凋亡。

A.死亡受体途径相关基因的mRNA表达水平；B.～C.死亡受体途径相关基因的蛋白质表达水平。

图6 SV处理的HepG2中线粒体途径相关基因的表达水平

Conclusion

本研究强调了SV通过抑制细胞凋亡，刺激HepG2癌细胞在G0/G1期的细胞周期停滞、ROS生成、诱导细胞凋亡、激活细胞死亡受体通路、促进线粒体通路的重要性。本研究结果为SV的细胞毒性或凋亡作用提供了一个有利的、具有启发性的模型系统。综上所述，SV作为一种植物性天然化合物，可以作为功能性食品使用。通过进一步的研究，SV将成为一种有前景的抗癌药物，扩大其在治疗肝癌方面的应用范围。

该文章《Stevenleaf from Gynostemma Pentaphyllum inhibits human hepatoma cell (HepG2) through cell cycle arrest and apoptotic induction》于2020年5月17日在线发表于Food Science and Human Wellness。

翻译：梁安琪；编辑：袁月；责编：张睿梅

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