杀菌方式对年糕贮藏期微生物多样性及品质的影响

以大米为原料的加工制品中，年糕是一种具有悠久历史和浓郁地方特色的半方便型传统小吃，其美味醇香、口感爽滑、营养丰富，深受消费者喜爱。但在年糕加工制作过程中，原辅料、半成品和成品都可能直接与空气或水相接触，其水分含量高且富含营养，极易受到细菌侵袭而腐败变质，不能适应市场流通销售的需要。

基于上述情况，河南工业大学粮油食品学院的孙同辉、陈 洁*、李雪琴*等人以年糕为对象，通过贮藏期菌落变化趋势分析杀菌方式对年糕微生物的影响，采用Illumina Miseq测序平台对其16S rDNA V3～V4区域扩增子测序分析，以期更深层次挖掘杀菌方式对菌群丰富度和多样性的影响，揭示不同杀菌方式下微生物的变化规律，同时通过品质物性测定结合感官评价等方法分析杀菌方式对年糕品质的影响，为保鲜技术的探索研究和靶向抑制腐败变质提供理论依据。

1、杀菌方式对年糕贮藏过程中菌落总数的影响

由图1年糕贮藏期间菌落总数变化趋势可知，年糕贮藏期间菌落总数随时间的延长逐渐增加，在0～3 d时，菌落总数增长较为缓慢，在3 d之后，样品中微生物适应新环境后迅速生长繁殖。空白样品组贮藏期间菌落总数增长迅速，在第3天时菌落总数达到5.37×104 CFU/g，已超GB 7099—2015《食品安全国家标准 糕点、面包》要求（低于104 CFU/g），失去食用价值；乙醇喷涂组初始菌落数为260 CFU/g，在3 d之后呈线性增长趋势，12 d时已接近104 CFU/g，在15 d菌落总数达到3.16×104 CFU/g；而水浴处理组0～6 d菌落总数增长速度较慢，在6 d时年糕中菌落总数为630 CFU/g，与乙醇喷涂组初始菌落总数接近，在6 d后增长迅速，在15 d时菌落总数约为7.76×103 CFU/g。在贮藏过程中，水浴处理组样品的菌落总数均低于乙醇喷涂组，原因可能是乙醇喷涂虽然有较好的杀菌效果，但渗透作用较差，对年糕内部微生物菌群作用较小，在贮藏过程中微生物会逐渐适应环境而迅速生长繁殖，而水浴处理可以有效对年糕表面进行杀菌，还可以通过热传递对年糕内部产生较好的杀菌效果，有效控制年糕体系中的初始菌落数，延缓年糕腐败，得到较长的货架期。

2、PCR扩增结果

以提取的基因组DNA作为模板，用1 6S rD N AV3～V4区的通用引物扩增出目的片段（图2），条带清晰，有明显主带，可以满足后续测序实验要求。

3、样品中细菌菌落多样性分析结果

单样本多样性（Alpha多样性）分析可以反映微生物群落的丰度和多样性，对97%相似水平下的操作分类单元（OTU）进行生物信息统计，由表2可见，所有样本的测序覆盖率均在96%以上，表明测序对样本中序列的覆盖率较高，未被测到的概率较低，满足样品中细菌多样性分析的需要。

采用ACE、Chao 1、Shannon和Simpon指数等多样性指标对样品微生物物种丰富度和多样性进行评估。空白样品组微生物可能主要是在年糕制作包装过程中原辅料、半成品和成品直接与空气或水接触所产生；乙醇喷涂组OTU数量减少，Simpson指数最高，Shannon指数最低，表明样品微生物多样性最低，主要原因首先可能是体积分数75%乙醇的灭菌作用明显，对菌群结构影响较大；其次，在贮藏过程中，微生物种间拮抗竞争关系筛选的优势菌群逐步成型，综合导致乙醇喷涂组菌群多样性降低。ACE和Chao 1指数较高，表明组内菌群丰富度较高；水浴处理组OTU数量增加，Shannon指数较高，

Simpson指数较低，说明水浴处理组在贮藏期内检测到新的菌种，菌群多样性增加，ACE和Chao 1指数明显降低，表明菌群丰富度较低，两种杀菌方式对年糕菌群丰富度及多样性影响较大。

Shannon指数曲线可以反映在不同测序量时微生物多样性，当曲线趋于平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。由图3可以看出，所有样本的曲线都随着样品序列数量增加而逐渐趋于稳定，说明测序数据量合理，所含菌种数较多。

4、基于OTU的Veen分析结果

基于样品总OTU数量作Veen图，进行相似性分析（图4）。空白样品组与水浴处理组共有的OTU数量195 个，空白样品组与乙醇喷涂组共有的OTU数量8 7 个，水浴处理组与乙醇喷涂组共有的OTU数量111 个，3 组样本共有的OTU数量69 个，占各样本OTU 数量比例较小，各样本特有的OTU 数量在2 145～3 015 个，各样本之间的菌群结构差异性较大，水浴处理和乙醇喷涂对年糕微生物群落结构影响较大。

5、杀菌方式对年糕中细菌群落结构的影响

由图5可以看出，空白样品组、水浴处理组和乙醇喷涂组所含微生物种类和数量有明显差异，水浴处理组和乙醇喷涂组微生物多样性低于空白样品组。

空白样品组肠杆菌科（Enterobacteriaceae）所占比例最大，为56.47 % ，其次为莫拉氏菌科 （Moraxellaceae），所占比例为34.84%，还有芽孢杆菌科（Bacillaceae）、链球菌科（Streptococcaceae）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae）等相对丰度较低的菌种，在年糕制作包装过程中污染微生物的种类复杂，导致样品菌落结构呈现多样性；水浴处理组在科水平下主要有Enterobacteriaceae（47.27%）、Moraxellaceae（40.75%）和Pseudomonadaceae（6.69%）和Bacillaceae（2.63%），Enterobacteriaceae相对丰度降低，Moraxellaceae相对丰度升高，Pseudomonadaceae相对丰度升高。Enterobacteriaceae耐热性较低，研究经验表明，只能通过一些手段去减少它们的存在，却不能完全将其杀灭，其表现为相对丰度降低；Moraxellaceae相对丰度升高，因为其对环境有较好的适应能力，在缺氧和高于最适温度培养时，可以促进多形态产生水浴处理使年糕内微生物丰富度和多样性大幅度降低，尤其对温度敏感的微生物菌群，年糕中微生物菌群总数量降低，对环境有较好耐受力的菌群比例略有升高，所以表现为Moraxellaceae和Bacillaceae相对丰度略有升高；乙醇喷涂组的菌群在科水平下主要有Moraxellaceae（82.22%）、Bacillaceae（10.74%）和Enterobacteriaceae（2.8%）。Moraxellaceae中有些菌属对消毒剂有一定的抗药性，所以呈现较高的相对丰度；Bacillaceae环境耐受能力强，可以形成孢子抵御有害环境，适应环境后繁殖迅速，表现为相对丰度略有升高，可能会成为年糕后期腐败的优势菌。

6、物种丰度聚类分析结果

如图6所示，在属水平，水浴处理组和空白样品组聚为一类，乙醇喷涂单独聚为一类，水浴处理组和空白样品组菌群整体结构相似度较高，与乙醇喷涂组相似度较低，表明乙醇喷涂对样品菌群结构影响较大。

由图7各样品中微生物组成比例可见，在属水平上，空白样品组优势菌群主要是Pantoea（36.06%）、Acinetobacter（34.55%）和Salmonella（18.1%），还有相对丰度较小的Exiguobactericm（2.48%）和Lactococcus（1.34%），空白样品中菌群分布较为均匀。在优势菌群中Pantoea所占比例最大，其属于兼性厌氧，是代谢和发酵类型的化能异养菌，为水稻内生细菌属，主要来自于原料大米中；Acinetobacter广泛分布于外界环境中，水和土壤中居多，黏附力极强，易于随空气传播污染。

7、杀菌方式对贮藏过程中年糕品质的影响

由表3可知，随着贮藏时间的延长，年糕杨氏模量、坚实度、韧性和咀嚼功等品质指标水平呈现上升趋势，弹性和黏性逐渐降低。在贮藏期内品质变化主要是年糕老化引起的，年糕属于淀粉质食品，淀粉回生是淀粉质食品老化的主要因素，淀粉回生主要是由淀粉的再结晶引起的。短期回生直链淀粉形成的晶核为支链淀粉回生提供了晶种源，随着贮藏时间的延长，支链淀粉外侧短链以双螺旋为基质，通过氢键堆积结晶，直链淀粉的存在加速了支链淀粉的重结晶，使得支链淀粉在重结晶后淀粉凝胶硬度增大，表现为杨氏模量、坚实度、韧性和咀嚼功逐渐增加，贮藏期间微生物生长与化学反应引起的水分含量减少，导致年糕弹性和黏性降低。

8、杀菌方式对年糕贮藏过程中感官品质的影响

年糕贮藏过程中感官评分的变化见图8，年糕在色泽、弹性、口感、硬度和风味各项评分和总分均随着贮藏时间的延长而降低，随着贮藏时间的延长，年糕色泽逐渐暗淡，弹性口感变差，且特征米香味消失。贮藏前3 d，空白样品组感官评分下降明显，水浴处理组与乙醇喷涂组样品感官评分下降趋势相同，说明两种杀菌方式均能有效抑制微生物生长繁殖，延缓年糕腐败并保证年糕有较好的品质；6 d后，空白样品组有异味产生，部分样品已呈现腐败状，不具有食用价值；两组的感官评分变化趋势不同，水浴处理组在第12天时，品质保持较好，乙醇喷涂组感官评分下降速度较快，口感逐渐变差，在第12天时，略有异味产生。感官评分是判断货架期的主要指标，水浴处理组较乙醇喷涂组的货架期延长，表明年糕采用水浴处理较乙醇喷涂的感官品质保持较好，水浴处理可以有效抑制微生物繁殖和油脂酸败，依据以上分析结果可以初步预测，25 ℃条件下，乙醇喷涂和水浴处理的两种年糕货架期分别可达12、15 d。

结 论

综合各项测定指标的变化规律和微生物菌群结构多样性的影响，水浴处理比乙醇喷涂更适合年糕保鲜，在贮藏过程中能更好地维持年糕品质。本研究为后期靶向抑制其腐败变质和保鲜工艺的探索提供了参考。

本文《杀菌方式对年糕贮藏期微生物多样性及品质的影响》来源于《食品科学》2020年41卷21期189-196页，作者：孙同辉，陈洁，李雪琴，陈玲。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191029-314。

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修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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