今天和大家分享是2021年1月19日发表在Oncogene上的一篇文章。这篇文章是由重庆医科大学柳满然教授实验室完成，题为A novel hypoxic long noncoding RNA KB-1980E6.3 maintains breast cancer stem cell stemness via interacting with IGF2BP1 to facilitate c-Myc mRNA stability。在这篇文章中，研究者将各种生物学数据库与生物实验结合，反复进行验证，思路严谨清晰，值得大家学习。最重要的是，大家一起学习一下LncRNAs的发文套路。

研究背景

根据GLOBOCAN最新的统计数据显示，乳腺癌年发病人数已达226万，成为全球年发患病人数最多的癌种。乳腺癌干细胞（BCSCs）作为肿瘤细胞的一个亚群，具有很强的自我更新能力和多向分化潜能。由于BCSCs的高度耐药性，传统的癌症治疗方法不足以根除BCSCs，导致乳腺癌治疗效果较差。长非编码RNA（LncRNAs）是一系列大于200个核苷酸的转录RNA，其编码蛋白质的能力有限或没有。越来越多的证据表明，LncRNAs在控制癌症相关的增殖、侵袭、迁移、凋亡等细胞过程起着关键作用。

本文鉴定出了与BCSCs存活相关的LncRNAs，即LncRNA KB-1980E6.3。该LncRNAs可通过LncRNA KB-1980E6.3/IGF2BP1/c-Myc通路维持BCSCs的干细胞特性，提示阻断该通路可能为难治性缺氧肿瘤提供一个新的治疗靶点。

研究内容

1、LncRNA KB-1980E6.3是一种新的缺氧性LncRNA，与乳腺癌预后不良相关

研究方法与结果：1）BT549细胞暴露于常氧（20%O2）或缺氧（1%O2）8小时，进行RNA-seq分析。通过对比，在缺氧条件下鉴定出181个上调和229个下调的LncRNAs，热图显示了前100个差异表达的LncRNAs（图1a）。

2）研究者选择了11个倍数变化大于5倍的上调LncRNAs，通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测它们在常氧或缺氧培养8小时的BT549细胞中的表达水平。结果显示，lncRNA KB-1980E6.3-001是缺氧条件下与常氧相比增加最多的LncRNA（图1b）。在其他缺氧性乳腺癌细胞中该结果得到了进一步验证（图1c）。

3）研究者评估了71对乳腺肿瘤及其邻近正常组织中LncRNA KB-1980E6.3的表达水平，发现与邻近正常组织相比，大多数肿瘤组织（40/71）显示出更高的LncRNA KB-1980E6.3水平（图1d）。并且LncRNA KB-1980E6.3的增加与乳腺癌患者的肿瘤分期呈正相关（图1e）。

4）研究者进一步分析来自TCGA数据库的1100个乳腺癌标本和113个正常标本。研究结果显示乳腺癌组织中LncRNA KB-1980E6.3的表达高于癌旁组织（图1f，g）。Kaplan–Meier生存曲线显示，高水平的LncRNA KB-1980E6.3与乳腺癌患者的低生存率密切相关（图1h）。

研究结论：这些研究结果强调了LncRNA KB-1980E6.3与乳腺癌预后不良相关。

图1 LncRNA KB-1980E6.3乳腺癌预后不良相关

2、缺氧增强型LncRNA KB-1980E6.3维持BCSCs干细胞特性

研究方法与结果：1）研究者建立了LncRNA KB-1980E6.3稳定的敲低或过度表达的BT549和Hs578T细胞株，RNA-seq分析显示，与常氧条件下的对照细胞相比，在LncRNA KB-1980E6.3高表达的肿瘤细胞中，2331个基因（1082个上调，1249个下调）差异表达（图2c，d）。

2）研究者利用京都基因和基因组百科全书（KEGG）路径数据库对这些基因进行分类。TNF信号通路、Hippo信号通路和调节干细胞多能性的信号通路均被鉴定出受到LncRNA KB-1980E6.3的影响。调节干细胞多能性的信号通路引起了研究者的注意，提示LncRNA KB-1980E6.3可能在BCSCs特性中起作用。

图2 LncRNA KB-1980E6.3维持BCSCs干细胞特性

3）研究者在乳腺癌细胞悬浮培养中发现缺氧可显著刺激悬浮培养中乳腺癌细胞的球体形成，LncRNA KB-1980E6.3的敲低可显著消除缺氧条件下乳腺癌细胞的球体形成能力（图2f–h）。

研究结论：缺氧增强型LncRNA KB-1980E6.3可维持BCSCs干细胞特性。

图2 LncRNA KB-1980E6.3维持BCSCs干细胞特性

3、LncRNA KB-1980E6.3通过增加c-Myc mRNA稳定性提高c-Myc蛋白水平

研究方法与结果：1）LncRNA KB-1980E6.3是否可能通过调节某些CSC相关基因或蛋白的表达而促进BCSCs的形成？经qRT-PCR和western-blot证实，在缺氧条件下LncRNA KB-1980E6.3敲低后，BT549和Hs578T细胞中的c-Myc基因明显下调（图3a）；而过表达 lncRNA KB-1980E6.3可增加这c-Myc基因的表达，尤其是常氧BT549和Hs578T细胞中的c-Myc基因更为明显（图3b）。WB验证也表明，LncRNA KB-1980E6.3对c-Myc蛋白水平的影响比其他多能干相关标记物（例如OCT4、KLF4、SOX2和Nanog）更明显（图3c、d）。

图3 LncRNA KB-1980E6.3提高c-Myc蛋白水平

2）研究者进一步评估了临床乳腺肿瘤组织中c-Myc的水平，在大多数肿瘤组织中检测到更高水平的c-Myc，并且它们的水平随着肿瘤分期而升高（图3e）。并且研究者观察到，LncRNA KB-1980E6.3高表达的肿瘤组织中的c-Myc蛋白远远高于LncRNA KB-1980E6.3低表达肿瘤组织中的c-Myc蛋白（图3g），并且LncRNA KB-1980E6.3水平与c-Myc蛋白得分呈正相关（图3h）。

3）分析TCGA数据库中乳腺癌组织中c-Myc和LncRNA KB-1980E6.3水平的相关性，研究者发现c-Myc mRNA和LncRNA KB-1980E6.3水平在乳腺肿瘤中呈正相关（图3f）。

图3 LncRNA KB-1980E6.3提高c-Myc蛋白水平

4）为了研究LncRNA KB-1980E6.3是否能在转录水平上影响c-Myc的表达，研究者进行了荧光素酶报告分析？数据显示，LncRNA KB-1980E6.3敲除对常氧或缺氧乳腺癌细胞中c-Myc的启动子活性没有影响（图4a，b），这提示LncRNA KB-1980E6.3可能在转录后水平调控c-Myc。

图4 LncRNA KB-1980E6.3增加c-Myc mRNA稳定性

5）研究者进一步测试了放线菌素D处理下c-Myc mRNA的稳定性。敲低LncRNA KB-1980E6.3导致c-Myc mRNA的半衰期降低（图4c，D），过表达LncRNA KB-1980E6.3可显著增加c-Myc mRNA的半衰期（图4e，f）。这些数据表明LncRNA KB-1980E6.3通过稳定c-Myc mRNA而密切调控c-Myc的表达。

研究结论：LncRNA KB-1980E6.3通过增加c-Myc mRNA稳定性提高c-Myc蛋白水平

图4 LncRNA KB-1980E6.3增加c-Myc mRNA稳定性

4、lncRNA KB-1980E6.3通过IGF2BP1结合增加c-Myc mRNA的稳定性

研究方法与结果：1）LncRNA KB-1980E6.3如何影响c-Myc mRNAs的稳定性呢？研究者利用了公共生物信息学资源，如RNA-蛋白质相互作用预测（RPISeq）网站。经RPISeq分析，IGF2BP1是潜在的能够与LncRNA KB-1980E6.3结合的RNA结合蛋白。

2）为了证实LncRNA KB-1980E6.3与IGF2BP1的相互作用，研究者采用针对IGF2BP1的抗体进行RNA免疫沉淀（RIP）分析。在缺氧的BT549和Hs578T细胞中发现含有IGF2BP1的LncRNA KB-1980E6.3显著富集（图5b）。并且c-Myc mRNA在缺氧条件下也明显富集于IGF2BP1免疫沉淀物中（图5c）。研究者进一步用RNA pull-down验证IGF2BP1和lncrnakb-1980E6之间的相互作用。IGF2BP1在缺氧的BT549和Hs578T细胞中与合成的正义LncRNA KB-1980E6.3而不是反义LncRNA KB-1980E6.3共沉淀（图5d）。

图5 LncRNA KB-1980E6.3可以与 IGF2BP1相互结合

3）研究者采用了定位分析研究LncRNA KB-1980E6.3结合的区域，数据显示，lncRNA KB-1980E6.3的第二个区域（201–400 nt）是其与IGF2BP1相互作用所必需的（图5e）。使用抗HA标记的全长或截短的IGF2BP1（RRM，KH结构域）的抗体进行了RIP分析。结果显示IGF2BP1的KH1/2结构域是缺氧BT549细胞中与lncRNA KB-1980E6.3结合所必需的（图5f）。

图5 LncRNA KB-1980E6.3可以与 IGF2BP1相互结合

4）m6A甲基化影响mRNA的稳定性，c-Myc 编码区（CRD）不稳定性决定簇有六个m6A共有序列，研究者将c-Myc 的m6A位点突变掉，以用来研究LncRNA KB-1980E6.3对m6A甲基化的影响。研究结果显示，在缺氧条件下，lncRNA KB-1980E6.3招募的IGF2BP1与c-Myc CRD WT的结合明显多于c-Myc CRD突变体（图6c），表明lncRNA KB-1980E6.3介导了缺氧BT549细胞中IGF2BP1和c-Myc CRD mRNA之间的识别。

5）在具有过表达WT c-Myc CRD的缺氧BT549细胞中检测到显著稳定的c-Myc mRNA，而在突变c-Myc CRD的细胞中则结果相反（图6e，f）。蛋白水平的检测结果相同（图6g）。

研究结论：LncRNA KB-1980E6.3通过与m6A读取器 IGF2BP1结合增加c-Myc mRNA的稳定性

图6 LncRNA KB-1980E6.3增加c-Myc mRNA的稳定性

5、lncRNA KB-1980E6.3介导的c-Myc稳定性对肿瘤发生至关重要

研究方法与结果：1）缺氧性lncRNA KB-1980E6.3介导的c-Myc稳定性是否在维持BCSCs干细胞特性中起关键作用？研究者将三个剂量（1×105、1×104和1×103）的来源于工程化Hs578T的球体和1×105的来源于工程化BT549的球体，包括shKB/载体、shKB/c-Myc、shIF2BP1/载体、shIF2BP1/c-Myc和shNC/载体对照细胞，皮下接种到4-6周龄雌性裸鼠（n = 5每组）。然后用贝伐单抗治疗小鼠形成缺氧肿瘤微环境，或用PBS治疗小鼠形成非缺氧状态。与PBS相比，贝伐单抗诱导的小鼠肿瘤缺氧微环境增加了肿瘤发生和肿瘤生长。与对照组相比，敲除Hs578T CSCs中的lncRNA KB-1980E6.3或IGF2BP1可显著降低肿瘤起始和肿瘤生长（图7b）。（这个结果真让人震惊丫！！！贝伐单抗诱导的小鼠肿瘤缺氧微环境增加了肿瘤发生和肿瘤生长？？？）

2）与对照肿瘤相比，贝伐单抗治疗的肿瘤有效地诱导了高水平的HIF-1α、lncRNA KB-1980E6.3和c-Myc（图7c，d）。

研究结论：缺氧诱导的LncRNA KB-1980E6.3/IGF2BP1/c-Myc轴对于BCSCs的维持是必需的，从而导致体内的肿瘤起始和肿瘤生长。

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图7 LncRNA-KB-1980E6.3介导的c-Myc稳定性对肿瘤发生至关重要

文章总结

这篇文章系统的阐述了从LncRNA KB-1980E6.3的发现到功能验证的全过程。文章在研究思路上清晰且不拖沓，结合生物信息学数据库与实验进行反复验证，将LncRNA KB-1980E6.3的功能讲述的非常清晰，值得研究者进行学习和借鉴。

参考文献：

Zhu P, He F, Hou Y, Tu G, Li Q, Jin T, Zeng H, Qin Y, Wan X, Qiao Y, Qiu Y, Teng Y, Liu M. A novel hypoxic long noncoding RNA KB-1980E6.3 maintains breast cancer stem cell stemness via interacting with IGF2BP1 to facilitate c-Myc mRNA stability. Oncogene. 2021 Jan 19. doi: 10.1038/s41388-020-01638-9. Epub ahead of print. PMID: 33469161.

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