精液来源外泌体开辟眼底病无创治疗新范式
视网膜母细胞瘤（RB）作为儿童最常见的眼内恶性肿瘤，因其位于视网膜的特殊位置以及眼组织的精细结构，长期以来面临严峻的治疗挑战。目前的治疗手段，如玻璃体内注射、放疗、冷冻疗法和全身化疗，常导致严重的眼部结构损伤和全身毒性反应，而对于存在眼外扩散风险的患者，眼球摘除术仍是无奈之选，这意味着永久性的视力丧失。这些局限性凸显了开发既能有效将药物递送至眼后段，又能最大程度减少副作用的无创、靶向治疗的迫切需求。眼后段受到血-视网膜屏障和角膜上皮等多重生物屏障的保护，严重限制了治疗药物的渗透，使得无创给药成为眼科领域的一大难题。
沈阳药科大学张宇教授团队利用精液来源的外泌体（SEVs）作为药物载体，实现无创的眼底递送。研究发现，SEVs 凭借其表皮生长因子（EGF）的表达，能够可逆地打开眼组织屏障的紧密连接，通过角膜和结膜双重途径高效到达眼后段。基于这一发现，研究团队构建了 FA-SEVs@CMG 滴眼液，将叶酸（FA）修饰的 SEVs 与一种由碳点（CDs）、二氧化锰（MnO₂）和葡萄糖氧化酶（Gox）组成的纳米酶系统（CMG）相结合。该滴眼液利用 SEVs 优异的穿透能力和 FA 的靶向作用，将药物高效递送至视网膜母细胞瘤细胞。内化后的 CMG 系统诱导强烈的氧化应激，破坏自噬-凋亡平衡，触发肿瘤细胞的自我毁灭。在体内实验中，FA-SEVs@CMG 有效抑制了 RB 的生长，同时保留了视网膜功能，为眼后段疾病的治疗提供了一种变革性的策略。相关论文以“Harnessing semen-derived exosomes for noninvasive fundus drug delivery: A paradigm for exosome-based ocular fundus therapeutics”为题，发表在Science Advances上，并被Nature作为研究亮点报道。
研究团队首先合成了具有双重功能的碳点（CDs）。通过一步溶剂热法，以柠檬酸、硫脲、氯化亚铁和硼酸为前驱体，制备出的 CDs 粒径均一（约4.14 nm），展现出优异的近红外荧光特性，发射峰位于621 nm，且光稳定性优于传统成像剂，这为后续实时追踪药物在眼内的分布奠定了基础。同时，通过高分辨透射电镜、元素映射和X射线光电子能谱等表征手段，研究人员确认了 CDs 中 Fe-N₃S-B/C 配位中心的原子结构，这种独特的结构赋予了 CDs 卓越的过氧化物酶（POD）样活性，能够在肿瘤微环境中高效催化产生活性氧（图2）。
图1. FA-SEVs@CMG 在视网膜母细胞瘤治疗中的作用机制示意图。 SEVs 能够暂时性破坏眼屏障的紧密连接，促进 CMG 向眼后段的递送。在肿瘤微环境中，CMG 产生强烈的氧化应激，扰乱自噬-凋亡的平衡，促使自噬从细胞稳态的守护者转变为细胞死亡的放大器，并通过激活外源性凋亡通路（BID-caspase-8）进一步促进凋亡，从而诱导视网膜母细胞瘤细胞的自我毁灭。
在确认了 CDs 的性能后，研究者从猪精液中成功提取并表征了 SEVs。透射电镜图像显示了 SEVs 经典的囊泡形态，动态光散射和纳米颗粒追踪分析证实其粒径约为120 nm，且具有良好的单分散性。Western blot 分析确认了 SEVs 表达典型的外泌体标志物（CD9、CD63、Alix），而几乎不含有细胞器污染，证明了分离产物的高纯度（图2）。
图2. CDs 的合成与 SEVs 的提取。 （A）CDs 合成方法的示意图。（B）CDs 的透射电镜和高分辨透射电镜图像；插图为计算的平均粒径（纳米）。（C）透射电镜能谱图谱估算的元素原子含量。（D）SEVs 收集与分离流程示意图。（E）SEVs 的透射电镜图像。（F）动态光散射（DLS）和（G）纳米颗粒追踪分析（NTA）测定的 SEVs 粒径（n=3）。（H）免疫印迹分析 SEVs 及上清液+精子细胞中表达的外泌体标志物（CD9、CD63 和 Alix）、内质网标志物（钙连蛋白）、线粒体标志物（COX IV）和细胞核标志物（组蛋白 H3）。
为验证 SEVs 的渗透能力，研究者将 CDs 装载入 SEVs（SEVs-CDs）并进行了体外角膜渗透实验。Franz 扩散池结果显示，SEVs-CDs 在10小时内的角膜累积渗透率高达14.0%，显著优于鱼精蛋白修饰的脂质体、肿瘤细胞来源外泌体以及游离 CDs。在离体角膜上皮细胞单层模型中，SEVs-CDs 的表观渗透系数（Papp）同样最高。更重要的是，在小鼠和兔眼组织切片中，SEVs-CDs 在滴眼后6小时迅速在视网膜-脉络膜区域富集，而游离 CDs 几乎未见明显信号。这些结果直观地证明了 SEVs 作为无创眼底递送载体的巨大潜力（图3，图4A-E）。
图3. SEVs 眼内渗透能力的研究。 （A）CDs、ProLs-CDs、SEVs-CDs 和 Y79Es-CDs 的粒径和 zeta 电位分布。（B）以兔角膜为膜的 Franz 透皮扩散示意图。（C）不同组别的体外兔角膜累积渗透百分比。（D）在指定时间点局部给予不同眼用制剂后，CDs 在小鼠眼组织和视网膜组织中分布的荧光共聚焦显微镜图像，以及（E）图像量化分析[4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）：蓝色，CDs：红色]。h，小时；a.u.，任意单位。（F）使用不同滴眼液后，CDs 在小鼠整个眼球中的穿透情况。数据以平均值 ± 标准差表示。图（B）、（C）和（E）中的 P 值通过单因素方差分析（ANOVA）与 Tukey 事后检验计算（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001）（n = 3）。
进一步的机制研究表明，SEVs 之所以能高效渗透眼组织，关键在于其能够可逆地调控细胞间的紧密连接。免疫荧光染色显示，SEVs 处理会导致角膜上皮细胞中 ZO-1、F-肌动蛋白、闭合蛋白和E-钙粘蛋白的表达降低，但与鱼精蛋白不同的是，SEVs 处理后的紧密连接蛋白在24小时内可恢复至正常水平。跨上皮电阻（TEER）监测结果也证实，SEVs 在1小时内引起约45%的可逆性电阻下降，而鱼精蛋白则导致27%的不可逆损失。这种可逆的、非破坏性的紧密连接重塑机制，使得 SEVs 在确保高效递送的同时，也保障了眼组织屏障的长期完整性（图4F-H）。
图4. SEVs 眼内渗透性的体内验证及机制研究。 （A）不同滴眼液处理后不同时间点收集的兔眼球共聚焦图像（DAPI：蓝色，CDs：红色）。应用 SEVs-CDs 滴眼液后1小时（B）、6小时（C）、12小时（D）和24小时（E）兔眼角膜、虹膜、视网膜和脉络膜、晶状体、玻璃体和房水中 CDs 的分布。（F）不同处理条件下 ZO-1 分布的免疫荧光成像和定量分析。（G）不同处理组孵育后人角膜上皮细胞（HCEC）单层中（Ga）E-钙粘蛋白和（Gb）闭合蛋白的 Western blot 分析。Western blot 条带强度使用 ImageJ 量化，并归一化至相应的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）水平。（H）暴露1小时及磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，在23小时内监测不同处理组 HCEC 的跨上皮电阻（TEER）。数据表示为平均值 ± 标准差。图（F）、（Ga）、（Gb）和（H）中的 P 值通过单因素方差分析与 Tukey 事后检验计算（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001）（n = 3）。
通过对不同品种猪来源的 SEVs 进行定量蛋白质组学分析，研究者发现 SEVs 的EGF表达水平与眼内渗透能力呈强正相关。利用 EGF 中和抗体处理 SEVs 后，其诱导紧密连接开放和促进眼内渗透的能力显著下降。进一步的信号通路研究证实，SEVs 通过其表面的 EGF 蛋白激活角膜上皮细胞上的表皮生长因子受体（EGFR），进而引发 Src 蛋白激酶磷酸化、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）表达上调，最终导致肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化，从而可逆地开放紧密连接。使用 EGFR、Src 或 MLCK 的特异性抑制剂，均可阻断 SEVs 的渗透增强效应（图5，图6）。这一系列实验首次揭示了 SEVs 介导眼屏障通透性的关键分子机制，为仿生纳米载体的设计提供了全新靶点。
图5. SEVs 的蛋白质组学分析及介导眼屏障穿透蛋白的筛选。 （A）样本相关性热图。（B）A至E组中 CD9、CD63 和 Alix 的表达水平。给药后6小时，A至E组 SEVs 渗透进入小鼠（C）和兔（D）眼睛的情况。E 组与 B 组（E）以及 D 组与 C 组（F）差异表达蛋白的火山图。（G）SEVs 中促进精子穿透生殖屏障的蛋白（如 PTGDS 和 ACRV1），以及与眼屏障紧密连接调控通路相关的蛋白的蛋白质组学筛选和定量分析。（H）蛋白表达谱与眼内渗透性指标间相关分析的热图可视化。
图6. EGF 影响 SEVs 眼内渗透性的机制。 （A）通过抗 EGF 抗体抑制 SEVs 相关 EGF 的 Western blot 验证。EGF 抗体抑制前后 SEVs 在小鼠（B）和兔（C）眼中的渗透效率。（D）EGF 抗体抑制前后 SEVs 对 HCEC 单层 TEER 的影响。（E）Western blot 分析 EGF、SEVs 或抗 EGF SEVs 处理的 HCEC 单层中 EGFR-Src-MLCK-MLC 通路的激活情况。与 EGFR/Src/MLCK 抑制剂（吉非替尼、达沙替尼和 ML-7）共处理的 HCEC 单层中，EGF（F）/SEVs（G）对 TEER 的调节作用。与 EGFR/Src/MLCK 抑制剂共处理的 HCEC 单层中，EGF（H）/SEVs（I）对 MLC 磷酸化的诱导作用。数据表示为平均值 ± 标准差。图（B）和（C）中的 P 值通过配对 t 检验计算（P < 0.0001）。图（D）、（F）和（G）中的 P 值通过单因素方差分析与 Tukey 事后检验计算（P < 0.05，P < 0.01，**P < 0.001，****P < 0.0001）（n = 3）。
在确证了 SEVs 的递送效率后，研究团队构建了针对 RB 的治疗体系 FA-SEVs@CMG。通过将装载有 CMG 纳米酶系统的 SEVs 表面修饰叶酸，实现了对肿瘤细胞的主动靶向。透射电镜和动态光散射等表征手段确认了该复合纳米系统的成功构建，其粒径约为142 nm，且保留了 SEVs 原有的渗透能力（图8）。体外细胞实验显示，FA-SEVs@CMG 能够通过网格蛋白介导的内吞和巨胞饮作用高效进入 Y79 视网膜母细胞瘤细胞，并定位于溶酶体酸性环境中，激活其酶活性（图8）。
图7. CDs 的原子结构表征。 （A）CDs 中 Fe K 边的 XANES 谱。（B）CDs、FeS₂、Fe 箔、FePc、Fe₂O₃ 和 FeO 的 EXAFS 谱的傅里叶变换 k² 加权 χ(k) 函数。（C）CDs 和参考样品（Fe 箔、FeS₂、FeO、Fe₂O₃ 和 FePc）的 k³ 加权 EXAFS 数据的小波变换等高线图。（D）CDs、Fe 箔、FeS₂、FeO、Fe₂O₃ 和 FePc 的 FT k² 加权 EXAFS 谱。（E）CDs 在 R 空间的相应 EXAFS 拟合曲线。插图：CDs 表面模型。（F）CDs 在 k 空间的 EXAFS 拟合曲线。
图8. FA-SEVs@CMG 的制备及细胞内抗癌治疗。 （A）FA-SEVs@CMG 在环境光（左）和 350 nm 激光照射（右）下的外观。（B）MnO₂、CMG 和 FA-SEVs@CMG 的透射电镜图像。（C）不同材料的动态光散射（DLS）粒径和（D）zeta 电位。（E）SEVs、SEVs@CMG 和 FA-SEVs@CMG 的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白分析。（F）游离 CDs、CMG、SEVs@CMG 和 FA-SEVs@CMG 在 Y79 细胞中孵育 1 小时和 4 小时的共聚焦荧光成像。各组 CDs 的荧光定量结果如右图所示。细胞核用 DAPI（蓝色）染色，溶酶体用 LysoTracker Green 染色。（G）温度和内吞抑制剂对不同组别在 Y79 细胞中细胞摄取的影响。以不同组别的非抑制内吞作用作为阳性对照。（H）通过 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）对 Y79 细胞中活性氧（ROS）进行共聚焦荧光成像。各组 ROS 荧光强度的定量结果如右图所示。数据以平均值 ± 标准差表示。图（F）中的 P 值通过配对 t 检验计算（*P < 0.001，**P < 0.0001）。图（G）和（H）中的 P 值通过单因素方差分析与 Tukey 事后检验计算（****P < 0.0001）（n = 3）。
在抗肿瘤机制方面，FA-SEVs@CMG 展现了三重杀伤效应。进入细胞后，CMG 系统在肿瘤微环境条件下发生级联反应：MnO₂ 消耗谷胱甘肽（GSH）并产生氧气，氧气进一步促进葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化为过氧化氢，过氧化氢又在 CDs 的过氧化物酶活性催化下生成大量羟基自由基（·OH），引发剧烈的氧化应激。这种氧化应激不仅诱导了铁死亡（表现为脂质过氧化物累积和 GPX4 下调），还导致线粒体膜电位崩溃，激活了内在凋亡通路（caspase-9/-3/-7 活化）。更重要的是，过度的氧化应激将自噬从保护机制转变为促死信号：自噬不仅无法挽救细胞，反而通过激活 BID-caspase-8 轴启动了外源性凋亡通路，形成恶性循环，最终导致肿瘤细胞自我毁灭（图9）。通过使用自噬抑制剂 3-MA 和活性氧清除剂 NAC，研究者进一步证实了这种应激强度依赖性的自噬-凋亡转换机制。
图9. FA-SEVs@CMG 的抗癌机制研究。 （A）不同处理组 Y79 细胞中 LC3/II、GPX4 和 Caspase-9 蛋白的 Western blot 结果。（B）有无 3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理时，Y79 细胞中 Caspase-3 和（C）Caspase-7 蛋白活性。（D）不同处理组 Annexin V/PI 染色的 Y79 细胞流式细胞术结果。（E）3-MA 处理下，不同处理组 Annexin V/PI 染色的 Y79 细胞流式细胞术结果。（F）有无 3-MA 处理时，不同处理组 Y79 细胞流式细胞术 Annexin V/PI 染色的定量结果。有无 3-MA 处理时，不同处理组 Y79 细胞中 Caspase-9、Bcl-2、Caspase-9 和 BID 蛋白的 Western blot 结果（G）无 3-MA，（H）有 3-MA。数据表示为平均值 ± 标准差。图（B）、（C）和（F）中的 P 值通过配对 t 检验计算（*P < 0.05 和 **P < 0.0001）（n = 3）。
在动物实验中，研究团队建立了原位 RB 小鼠模型。结果显示，FA-SEVs@CMG 滴眼液治疗组的小鼠眼内生物发光信号显著减弱，肿瘤面积仅相当于对照组的2.35%，而游离 CDs 组和 CMG 组的肿瘤负担依然很高。组织切片染色进一步证实了 FA-SEVs@CMG 的卓越抗肿瘤效果，同时，视网膜电图（ERG）检测显示，接受 FA-SEVs@CMG 治疗的小鼠保留了近乎正常的视网膜功能（图10）。荧光成像结果还显示，FA-SEVs@CMG 能够实时监测肿瘤大小，体现了其诊疗一体化的潜力。在安全性评估方面，研究者对 SEVs 来源进行了严格的病毒检测，证实其安全性。长期给药后的组织病理学检查、眼压监测和免疫反应分析均未发现明显的毒副作用或眼内免疫激活，证实了该制剂具有良好的生物相容性（图10）。
图10. FA-SEVs@CMG 在 RB 小鼠体内的药效学研究。 （A）建立 RB 模型及动物实验设计的示意图。（B）30天内不同处理后 Y79 RB 小鼠的代表性体内生物发光图像及平均生物发光信号定量结果（Ba）。（C）不同处理30天后，小鼠眼睛的代表性图像和（D）苏木精-伊红（H&E）染色切片。（Da）图（D）中肿瘤面积的定量结果。（E）不同处理后 RB 小鼠在暗适应条件下的代表性视网膜电图（ERG）波形响应。虚线表示阳性对照组的 a 波和 b 波值。（F）不同处理后 RB 组织中 P62、TUNEL 和 Ki-67 的代表性免疫荧光结果。数据表示为平均值 ± 标准差。图（Ba）和（Da）中的 P 值通过单因素方差分析与 Tukey 事后检验计算（n = 3）（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001）。
总而言之，这项研究首次建立了基于精液来源外泌体的无创眼后段递送平台，成功解决了外泌体药物在眼部无创递送领域的核心瓶颈。通过揭示 SEVs 依赖 EGF-EGFR 信号轴可逆调控紧密连接的机制，研究不仅为眼底病治疗提供了新的载体选择，更为开发仿生纳米载体指明了方向。FA-SEVs@CMG 滴眼液集高效穿透、主动靶向、多重杀伤和实时监测于一体，在视网膜母细胞瘤模型中取得了显著的治疗效果，同时保留了宝贵的视力。这一突破性成果不仅为视网膜母细胞瘤的患儿带来了新的希望，也为年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等其他眼后段疾病的治疗提供了具有广阔应用前景的通用策略。尽管临床转化仍面临规模化生产、标准化和免疫原性等挑战，但该研究无疑为眼后段疾病的治疗范式带来了深刻的变革。
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