近日，内蒙古农业大学张和平教授团队在Journal of Dairy Science在线发表题目为“Metabolic footprint analysis of volatile metabolites to discriminate between different key time points in the fermentation and storage of starter cultures and probiotic Lactobacillus casei Zhang milk”的研究论文。本研究利用基于GC/MS的代谢组学方法，对发酵剂和LcZ在发酵和贮存过程中不同时间点的挥发性代谢产物及其动态变化进行了深入研究。张和平教授为本文的通讯作者。

INTRODUCTION

在过去的几十年里，益生菌的作用被广泛报道，包括对复合碳水化合物的消化、维生素和氨基酸的产生、胃肠道疾病缓解、免疫调节作用以及预防细菌感染。发酵乳是益生菌的良好载体，益生菌与发酵乳的结合能够具有更好的益生功能。本研究中，内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室的Yaru Sun、Chuantao Peng和张和平等人以中国内蒙古地区采集的传统发酵乳制品马奶酒（koumiss）样本中分离出的一种新型益生菌菌株——Lactobacillus casei Zhang（LcZ）为研究对象，其具有优良的发酵特性，使酸奶具有独特的风味和良好的质地。

有研究报告指出，发酵剂与益生菌的共同发酵有助于产生所需的挥发性代谢产物，例如乙醛和二乙酰，并能改善酸奶的风味。益生菌发酵酸奶的益生作用及其独特风味是市场竞争的一个重要因素。代谢组学可用于定性和定量分析低分子量代谢物，并已在食品科学中用于监测代谢情况。固相微萃取（SPME）与GC/MS联用已广泛应用于分析发酵牛奶、发酵豆奶和羊奶奶酪中的风味物质。

图1. 研究设计方案

研究在6 个关键时间点【发酵起始（FI）、发酵凝乳（FC）、发酵终止（FT）、贮藏1 d（S1d）、贮藏7 d（S7d）、发酵剂和LcZ乳在发酵过程中贮藏14 d（S14d）、发酵剂和LCZ乳在发酵过程中贮藏14 d（S14d）】的代表性代谢物及其代谢变化的实验方法简化方案。

以往的代谢组学研究表明，添加与未添加益生菌发酵的酸奶其挥发性代谢谱不同。然而，这些研究关注的是发酵结束时的代谢差异，而不是发酵和贮存过程中的代谢差异。对于何时产生特定的挥发性代谢物还知之甚少。由于所形成的挥发性代谢产物可能直接影响酸奶的感官品质，这些信息将为挥发性代谢物的时间特异性曲线研究提供宝贵的见解。在本研究中，作者团队利用GC/MS代谢组学技术进行代谢足迹分析和挥发性代谢物的鉴定，从而区分发酵剂和LcZ乳在发酵和发酵后贮存过程中的6个时间点，即发酵起始（FI）、发酵凝乳（FC）、发酵终止（FT）、贮藏1 d（S1d）、贮藏7 d （S7d）、贮藏14 d（S14d）。

RESULTS

  • 比较发酵和发酵后贮存过程中6 个时间点的代谢曲线

图2. 发酵和发酵后贮存过程中6 个时间点的代谢图谱

(a) 使用偏最小二乘判别分析对6 个时间点的挥发性代谢物进行分析[发酵起始（FI）、发酵凝乳（FC）、发酵终止（FT）、贮存1 d（S1d）、贮存7 d （S7d）、贮存14 d（S14d）] 。(b) 6 个样品代谢图谱的热图和层次聚类。(c) 用变量投影重要性（variable Importance in projection ,VIP）分析鉴定可用于区分不同时间点的挥发性代谢物。

使用R2Y（拟合优度）and Q2（预测能力参数）来验证PLS-DA模型的准确性和可预测性。R2Y和Q2值分别为0.99和0.83，相对较高（接近于1），表明模型具有较好的准确性和可预测性。PLS-DA得分图（图2a）显示，除了S7d和S14d，大部分时间点（FI、FC、FT和S1d）均有明显区别。这说明发酵和贮存过程中代谢谱发生了动态变化，S7d和S14d代谢谱基本相同。接下来，生成了6 组样本的代谢谱，并通过层次聚类对其进行分析，以可视化发酵和贮存过程中各时间点的特异性代谢谱（图2b）。聚类分析还显示，6 组样本呈现6 个小聚类，与PLS-DA结果相对应。对不同时间点可用于鉴别的挥发性代谢物进行VIP分析鉴定。鉴定出15 种挥发物：戊酸（pentanoic acid）、乙偶烟（acetoin）、2-羟基-3-戊酮（2-hydroxy-3-pentanone）、2-壬醇（2-nonanol）、辛酸（octanoic acid）、苯甲醛（benzaldehyde）、3-甲基-2-丁烯-1-醇（3-methyl-2-buten-1-ol）、2-癸烯（2-decenal）、2,3-丁二酮（2,3-butanedione）、己酸（hexanoic acid）、癸酸（decanoic acid）、己醛（hexanal）、1-壬醇（1-nonanol）、5-甲基-1-己醇（5-methyl-1-hexanol）、和3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇（3,7-dimethyl-1,6-octadien-3-ol）（图2c）。

  • 发酵起始（FI）与发酵凝乳（FC）代谢足迹的差异

图3.发酵起始（FI）与发酵凝乳（FC）代谢足迹的差异

根据以上多元统计分析的标准，我们使用Venny和PLS-DA比较了FI和FC时期的挥发性代谢产物。代谢足迹差异如图3所示。有14 种挥发物仅在FI处出现：壬醛、己醛、庚醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、癸醛、2-吡啶甲酸、(1-丁基戊基)-苯、二甲基砜、3-羟基丁醛、甲磺基乙酸、十二烷、2,4-二甲基癸烷、癸酸和2,4,6-三甲基癸烷。有8 种挥发物仅在FC出现：2,3-丁二酮、3-羟基丁酮、2,3-戊二酮、己酸、辛酸、1-乙基丁基氢过氧化物，1-庚醇和1-己醇。FI和FC共有16 种挥发物，其中6 种挥发物经VIP鉴定为差异显著的挥发物。在PLS-DA模型中，R2Y和Q2值分别为0.99和0.53。这6种化合物分别是1-壬醇、1-辛醇、2-十一烷酮、2-壬酮、3-甲基-2-丁酮和2-庚酮。

  • 发酵凝乳（FC）和发酵终止（FT）之间代谢足迹的差异

图4.发酵凝乳（FC）和发酵终止（FT）之间代谢足迹的差异

根据以上多元统计分析的标准，我们使用Venny和PLS-DA比较了FC和FT的挥发性代谢产物，代谢足迹差异如图4所示。有8 种挥发物仅在FC出现：3-甲基-2-丁酮、1-壬醇、苯甲醛、十四烷、1-乙基丁基过氧化物、d-柠檬烯、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇和1,3,5-环庚三烯。有19 种挥发物仅在FT出现：环氧乙烷、乙酸、乙醛、戊酸、1-(乙硫基)-丁烷、2-羟基-3-戊酮、2-氧代丙酸、癸酸、十二烷、十七烷、2-吡啶羧酸、壬醛、(E)-2-癸烯醛、3-羟基丁醛、二甲基砜、1-辛烯-3-醇、2,4-二甲基癸烷、3-甲基-2-丁烯-1-醇、癸醛。FC和FT共有16 种挥发性物质，其中5 种化合物使用VIP鉴定为有显著差异的挥发性物质。在PLS-DA模型中，R2Y和Q2值分别为0.98和0.85。这5种化合物分别是是己酸、辛酸、丁基羟基甲苯、2,3-丁二酮和3-癸炔-2-醇。

  • 发酵终止（FT）和贮存1 d（S1d）之间代谢足迹的差异

图5.发酵终止（FT）和贮存1 d（S1d）之间代谢足迹的差异

根据以上多元统计分析的标准，我们使用Venny和PLS-DA比较了FT和S1d的挥发性代谢物；代谢足迹差异如图5所示。有11 种挥发物仅在FT出现：2-氧代丙酸、十二烷、2-吡啶羧酸、壬醛、丁基羟基甲苯、3-羟基丁醛、1-辛烯-3-醇、2,4-二甲基癸烷、3-甲基-2-丁烯-1-醇、对二甲苯、癸醛。有4 种挥发物仅在S1d出现：3-甲基-2-丁酮、苯甲醛、2-壬醇和苯甲酸。FT和S1d共有24 种挥发物，其中8 种挥发物经VIP鉴定为有显著差异的挥发物。在PLS-DA模型中，R2Y和Q2值分别为0.84和0.56。这8 个化合物分别是乙醛、1-(乙硫基)-丁烷、3-癸烯-2-醇、辛酸、1-庚醇、2,3-丁二酮、己酸和癸酸。

图6. 不同贮存期间代谢足迹的差异

使用Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）和偏最小二乘判别分析比较（a） 贮存 1 d （ S1d ）和 7 d （ S7d ）；和贮存（ b ） 7 d （ S7d ）和 14 d （ S14d ）的挥发性代谢物。

  • 贮存1 d（S1d）和7 d（S7d）之间代谢足迹的差异

根据以上多元统计分析的标准，我们使用Venny和PLS-DA比较了S1d和S7d的挥发性代谢物；代谢足迹差异如图6a所示。有4 种挥发物仅在S1d出现：环氧乙烷、苯甲醛、二甲基砜、1-(乙硫基)-丁烷。有13 种挥发物仅在S7d期出现：二甲胺、2-氧代丙酸、1-辛烯-3-醇、2-丁基-1-辛醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、壬醛、对二甲苯、丁基羟基甲苯、3-羟基丁醛、癸醛、甲磺酰乙酸、庚醛、1,3,5-环庚三烯。S1d和S7d共有24 种挥发物，但没有一种挥发物被鉴定为有差异显著的挥发物。

  • 贮存7 d（S7d）和14 d（S14d）之间代谢足迹的差异

比较了S7d和S14d的挥发性代谢产物；代谢足迹的差异如图6b所示。有5种挥发物仅在S7d期出现：2-氧代丙酸、十七烷、苯甲酸、1-庚醇和对二甲苯。有5 种挥发物仅在S14d期出现：环氧乙烷、1-（乙硫基）-丁烷、5-甲基-1-己醇、十四烷和d-柠檬烯。S7d和S14d共有32 种挥发物，但这些化合物均未鉴定为有差异显著的挥发物。

DISCUSSION

图7. 代谢途径。本研究中已知的10 种挥发性代谢物的代谢途径。

在不同发酵阶段的挥发性代谢物中，有10 种普遍存在于发酵乳中，目前已知其在乳酸菌中的代谢途径，并且对发酵乳的质量和感官特性有显著贡献。这10 种代谢物分别是2,3-丁二酮、3-羟基丁酮、2-戊酮、2-庚酮、乙醛、1-庚醇、1-辛醇、己酸、癸酸和辛酸。图7为这些代谢产物的已知代谢途径。有趣的是，这10 种代谢产物都在S14d达到峰值，这表明随着贮存的进行，LcZ可能有助于改善风味品质。

CONCLUSIONS

本研究利用基于GC/MS的代谢组学方法，对发酵剂和LcZ在发酵和贮存过程中不同时间点的挥发性代谢产物及其动态变化进行了深入研究。在鉴定出的52 种挥发性代谢物中，有15 种有助于区分这6 个时间点。我们的时间间隔比较（FI∶FC、FC∶FT、FT∶S1d、S1d∶S7d、S7d∶S14d）显示了从一个发酵阶段到下一个发酵阶段的代谢进展不同。在特定的发酵和贮存时间点发现了具有代表性和独有的代谢产物。FC和FT之间代谢产物差异最大，S7d和S14d之间代谢谱最相似。结果表明，癸酸、辛酸和己酸在贮存14 d时达到最高水平，表明LcZ发酵乳在发酵后贮存可提高益生菌的功能。

该文章《Metabolic footprint analysis of volatile metabolites to discriminate between different key time points in the fermentation and storage of starter cultures and probiotic Lactobacillus casei Zhang milk 》于2021年3月1日在线发表于 Journal of Dairy Science 。 点击下方 阅读原文 即可查看摘要原文。

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翻译/编辑：袁月；责编：张睿梅

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