两耳不闻窗外事，一心只想发 CNS

天下风云出我辈，一心只想发 CNS

如何才能发一篇 CNS？整个实验室的人都愁得快秃头了。

像我们做基因研究，想要做好实验发文章，首先要选好研究策略，掌握了研究策略再进行细胞水平或动物水平验证。

听起来很简单，但实验后发现并不是那么回事。即便按流程仔细做，实验数据也跟闹着玩似的，一次一个样，那什么时候才能发 CNS，说起来都是泪。

不过，现在问题好像迎来了转机。

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我们知道，基因功能研究中常用两种基础策略，功能减弱或缺失，功能增强或获得。

实现基因功能减弱，可以采用 RNA 干扰（RNAi）技术下调目的基因表达。在 RNAi 使用中，siRNA 或 shRNA 的设计是关键。

长度约为 21 bp 的 siRNA 与蛋白形成 RISC 复合物，结合目的基因的 mRNA，从而使其降解，达到降低基因表达水平的目的（注意 RNAi 是作用于 mRNA 水平）。

但需要引起注意的是，如果目的基因在细胞中本体表达就较低的情况下（一般 ∆CT＞16），就不适合用 RNAi 了。

随着 CRISPR/Cas9 技术的成熟，越来越多的科研人员采用基因敲除的方式实现基因彻底缺失的目的。

与 RNAi 不同的是，基因敲除理论上可作用于基因组上所有的基因片段，并使目的基因的蛋白完全不表达，从而更有利于观察细胞表型的变化，简单来说，就是更容易做出实验结果。

CRISPR/Cas9 基因敲除和 RNAi 干扰表达，哪种调控方式更好？

没有更好，只有最适合！

两种方法没有绝对的好坏，通常 RNAi 技术由于操作简便，使用广泛，但CRISPR/Cas9 可使基因功能丧失更彻底，因此近些年受到广泛追捧。

某些情况下不适合用 RNAi，例如需要改变无法转录的 DNA 区域，只能用基因敲除。

某些特殊情况，敲除该基因会导致细胞生长缓慢，停滞甚至死亡，这样获得基因敲除细胞株比较困难，因此就需要选择通过 RNA 干扰的手段实现功能减弱。

干扰和敲除可实现基因功能缺失或减弱，那么实现基因功能增强或获得则需使用过表达和基因敲入了。

过表达和基因敲入，如何选择？

上调表达使得功能增强通常采用的方法是将目的基因的编码区（CDS）构建到载体中，导入细胞内使目的基因的表达量显著增加。

但基因在细胞内本体表达已经很高时，此时再进行过表达的调控，细胞的表型很可能不会发生变化，此外，外源高表达对细胞也是个刺激压力，会产生假阳性和假阴性的结果。

而对于功能获得，则常采用基因敲入的方法，例如引入标记基因序列，便于目的基因的示踪和定位，或引入调控表达元件如增强子，调控目的基因的表达；但由于受到同源重组效率和插入基因片段大小的影响，目前细胞基因敲入存在较高的技术难度，普通实验室难以开展。

做细胞功能验证，实验虐我千百遍，问题太多该找谁？今天，我们要喂你送上一颗定心丸，从此打怪升级，发 CNS 不在话下。

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图文来源：赛业生物

题图来源：图虫创意